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研究目的和背景肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球肿瘤患者主要死亡原因之一。由于早期诊断困难,缺乏有效的治疗措施,肝癌患者总体预后很差,肝癌5年生存率不足5%。因此肝癌的早期发现非常重要,阐明肝癌发生机制将有助于寻找早期诊断肝癌的肿瘤标记物。ErbB4是跨膜酪氨酸激酶的表皮生长因子受体家族成员之一。该基因在正常人体组织中有不同的表达,其中以大脑和心脏表达水平最高。ErbB4能与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子 α(transforming growth factor-α,TGF-α)、β-细胞素(betacellulin,BTC)、肝素结合的表皮因子(heparin-bingding EGF,HB-EGF)等配体结合并被激活,最终启动下游信号通路。这些研究表明,ErbB4极有可能参与调控肿瘤的发生发展,然后,其在肿瘤尤其在肝癌发展进程中的作用及调控机制仍不清楚,有待进一步明确。本文将综合运用细胞、动物实验以及临床标本的检测,研究ErbB4在肝癌发展进程中的作用及可能的调控机制,以期为肝癌的预防及靶向治疗提供新途径。研究方法1.ErbB4在临床肝脏相关疾病及肝癌组织中表达水平检测及相关分析通过对104例肝正常、炎症、硬化、癌组织及90例配对肝癌组织进行免疫组织化学染色检测ErbB4的表达情况。免疫组织化学染色的强度和定位等由具有执业医生资格的两位医师采用盲评的方式独立评估。表达强度的判断标准如下:棕褐色(3分)、棕色(2分)、淡黄色(1分)、无着色(0分);着色细胞比例:≤25%(1分)、26%-50%(2分)、51%-75%(3分)、>75%(4分)。最终的评分值为表达强度乘着色细胞比例(0-12分)。然后采用统计方法对评分值与患者的临床特征进行相关性分析。2.构建小鼠急性肝损伤模型C57小鼠,分两组分别按0.25μl/g剂量腹腔注射橄榄油容液、20%CC14(橄榄油稀释)溶液,于注射12h、24h、48h及72h后比较两组小鼠的肝脏损伤程度及ErbB4 mRNA表达情况(模型一)。ErbB4-/-HER4heart转基因小鼠及同窝ErbB4+/+小鼠,分别给予腹腔注射以0.5ml/25g剂量LPS工作液,于注射1h、3h、13h后比较两组小鼠的肝脏损伤程度及炎症细胞因子mRNA表达情况(模型二)。3.构建小鼠肝肿瘤模型选取出生后14-15天的同窝雄性小鼠中的ErbB4+/+HER4heart小鼠及ErbB4-t-HER4heart小鼠按25mg/kg的剂量的DEN给予腹腔注射,然后于出生后32周牺牲它们并比较两组小鼠的肝脏形成肿瘤的个数及大小和血清中ALT/AST含量(模型一)。选取出生后14-15天的同窝雄性小鼠中的ErbB4+/+HER4heart小鼠及ErbB4-/-HER4hart小鼠按25mg/kg的剂量的DEN给予腹腔注射。接着于出生后8周开始给予腹腔注射0.25μl/g 20%CCl4,每周2次,至小鼠20周龄后牺牲它们并比较两组小鼠的肝脏形成肿瘤的个数及大小和血清中ALT/AST含量(模型二)。4.ErbB4抑制肝脏肿瘤发生发展的作用机制4.1选取DEN诱导小鼠肝肿瘤模型中两组小鼠肝脏3对并抽提RNA,然后对抽提的3对小鼠肝脏RNA进行全基因组表达谱分析并筛选出差异明显的基因。接下来用real-time PCR对筛选出的差异基因进行进一步验证。4.2 首先检测肝癌细胞系 Huh-7、HepG2、BEL-7402、Sk-hep-1,QGY-7703、SMMC-7721、MHCC-97-H、MHCC-97-L、HCCLM6 及 423 在 mRNA 及蛋白水平上ErbB4的表达情况,选取高表达ErbB4的细胞株进行干扰。随后用real-time PCR对小鼠表达谱筛选出的差异基因在人肝癌细胞系水平进行进一步验证并锁定有差异的基因。最后通过Western Blotting及文献挖掘进一步探寻差异基因与ErbB4的相互作用关系。结果1.ErbB4在临床正常肝、肝炎、肝硬化及肝癌组织中蛋白表达水平检测及相关分析通过免疫染色评分及分析后,发现ErbB4的表达与患者性别、年龄、肿瘤的分期无明显相关性(P>0.05);然而,肝癌组织比临床正常肝、肝炎、肝硬化及配对的癌旁组织ErbB4的表达低(P<0.05);单独分析癌组织中ErbB4的表达情况发现,它与的分化相关(P<0.01),肿瘤分化越低ErbB4表达越低。随后将90例肝癌患者肝脏组织ErbB4评分进行了探索性分析,将评分≥8分(中位值)的归为ErbB4高表达组(n=23),评分<8分的归为ErbB4低表达组(n=67),采用Kaplan-Meier法分析结果提示低表达组生存时间明显短于高表达组(χ2=6.836 P=0.009)。2.小鼠急性肝损伤模型2.1野生型C57小鼠CC14诱导的急性肝损伤模型:小鼠血清中ALT/AST含量20%CCL4处理的实验组要比OIL处理的对照组高(P<0.01)。20%CCL4处理的实验组较对照组小鼠肝脏随时间进展肝细胞变性更严重,出现坏死更早,面积更大,汇管区浸润的炎细胞更多。经RT-PCR及Western Blotting检测,发现实验组中ErbB4的表达水平均低于对照组(P<0.01),且整体趋势表现为炎症早期急剧下降,修复期又逐渐恢复。2.2 ErbB4+/+与ErbB4-/-小鼠LPS诱导的急性肝损伤模型:ErbB4+/+HER4heart与ErbB4-t-HER4heart小鼠的基因型鉴定,150bp为野生条带,而320bp为ErbB4突变条带。与ErbB4+/+组小鼠相比,ErbB4-/-HERheart组小鼠血清中ALT/AST值更高(P<0.01);给药后肝窦及血管高度扩张充血更为明显,小叶中央静脉周围及汇管区浸润炎细胞数量更多;炎症相关细胞因子上升更快。3.小鼠肝肿瘤模型3.1 DEN诱导的小鼠肝肿瘤模型:ErbB4-/-HER4heart小鼠血清ALT值要比ErbB4+/+小鼠高(P<0.01);但AST值两组未见显著差异(P=0.59)。肉眼观ErbB4-/-HER4heart组小鼠的成瘤率100%。且与ErbB4+/+组小鼠相比,小鼠肝脏表面形成的肿瘤个数明显更多(P<0.05)。3.2 DEN+CCL4诱导小鼠肝肿瘤模型:ErbB4-/-小鼠血清AST值要比ErbB4+/+小鼠高(P<0.01);但ALT值两组未见显著差异(P=0.067)。肉眼观两组小鼠的成瘤率均为100%且肝脏表面粗糙,在肿瘤直径>2mm的个数中ErbB4-/-组要比ErbB4+/+组多(P<0.05)。4.ErbB4抑制肝脏肿瘤发生发展的作用机制4.1通过小鼠全基因组表达谱芯片对DEN诱导的两组肝肿瘤模型小鼠肝脏组织中的基因表达情况进行了分析。结果显示与ErbB4+/+组相比,ErbB4-/-组显著改变的探针信号包含了 12个表达下降的基因以及2个表达上升的基因。随后通过RT对12个表达下降的基因进一步筛选验证,结果表明7个与芯片分析结果一致。4.2通过RT及WB检测了 10株肝癌细胞系的情况,结果提示Huh-7,QGYQ-7703ErbB4表达相对较高。接着对两株细胞的ErbB4进行干扰后,用RT对两组小鼠筛选的7个基因进行验证,结果显示NR4A1/TR3及IL1B表达同样下降。4.3通过文献挖掘,一旦ErbB4与相关配体结合后,形成二聚体并结合一分子ATP,激活自身酪氨酸激酶活性,并促使胞内的磷酸化位点发生磷酸化。磷酸化的胞内段在肿瘤坏死因子α转化酶(TNFα-converting enzyme,TACE)及γ分泌素(γ-secretase)作用下水解并释放至胞浆,随后与STAT5A结合后进入细胞核并调控NR4A1/TR3的转录并使其在核内聚集。TR3作为核内受体,它可以从细胞核迁移到细胞浆,定位于线粒体,与线粒体上的Bcl-2结合,改变其构想,使其从抗凋亡蛋白变成促凋亡蛋白,触发线粒体内细胞色素C(Cytochrome c,Cytc)的释放,最终致肿瘤细胞凋亡。结论:1.肝癌组织中ErbB4表达低于正常、肝炎、肝硬化组织及相对应的癌旁组织;肿瘤细胞分化越低,ErbB4表达越低;ErbB4表达越低,患者的预后越差,生存期也越短。2.两种小鼠急性肝损伤模型提示,敲除ErbB4后可以促进炎症的发展。3.两种小鼠肝肿瘤模型表明,敲除ErbB4后可以促进肝肿瘤的发生发展,提示ErbB4是肝细胞肝癌的抑癌基因。4.在HCC中ErbB4发挥抑癌基因的作用机制是,一旦ErbB4激活,其胞内段被水解释放至细胞浆,随后与STAT5A结合迁移至细胞核调控NR4A1/TR3的转录。大量聚集的TR3可以迁移出细胞核,与定位于线粒体上的Bcl-2结合形成复合体,诱导线粒体内Cytc的释放,最终诱导肿瘤细胞凋亡。