近年来非发酵菌在临床分离的致病菌中呈增长趋势,其中最重要的菌种是不动杆菌和铜绿假单孢菌,不动杆菌中又以鲍曼不动杆菌最常见。不动杆菌为条件致病菌,广泛分布于水、土壤、医院环境和人体的皮肤表面。目前,鲍曼不动杆菌已成为继铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌之后的重要临床分离致病菌。近几年来,多重耐药或泛耐药的鲍曼不动杆菌已经在全球各地出现播散或暴发流行,并且耐药率也不断上升。世界各地相继报道了多重耐药或泛耐药的鲍曼不动杆菌的暴发流行。欧洲、北美、中国大陆、中国台湾、日本和韩国等。碳青霉烯类抗生素对不动杆菌具有较好的抗菌活性,是治疗不动杆菌重症感染的首选抗生素。近年来,世界各地都收集到对碳青霉烯类抗生素耐药的鲍曼不动杆菌,并且暴发流行。研究和预防抗生素耐药性的国际网络组织将不动杆菌中出现碳青霉烯类抗生素耐药菌称之为全球性的标志性事件,呼吁进行正确的流行病学干预和微生物学干预。不动杆菌属至少有33种基因型,其中醋酸钙不动朴菌、鲍曼不动杆菌、不动杆菌菌属3型(AGS)以及不动杆菌菌属13TU(sensu Tjernberg and Ursing)高度的基因型和表型的相似性,使其在常规的临床诊断实验室很难被区分开来,被统一归类于醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体。目前研究所示鲍曼不动杆菌逃避碳青霉烯类抗生素的耐药机制尚不明晰,和其他革兰氏阴性杆菌一样主要从以下几方面进行研究:①产生水解药物的碳青霉烯类酶;②与青霉素结合蛋白的亲和力降低;③外膜通道蛋白表达下调或缺如,使透入细菌外膜的药量减少;④细菌膜上的主动外排泵将透入菌膜的药物泵出体外。碳青霉烯类酶是指能够水解至少一种碳青霉烯类抗生素的一类β-内酰胺酶。包括Ambler分类中的A、B、D类酶。不动杆菌属中最重要的碳青霉烯类酶是D类酶,在鲍曼不动杆菌中报道的D类酶主要是OXA-23类;OXA-24类;OXA-51类和OXA-58类。目前认为OXA-51类在鲍曼不动杆菌中是天然存在的。碳青霉烯类酶对碳青霉烯类抗生素的水解活性较低,它对耐药性的介导常合并外膜通透性的降低和主动外排泵的参与。在非发酵菌中外膜蛋白在碳青霉烯类抗生素的流入中起作用,它们的改变可以降低细菌对抗生素的渗入。有研究认为分子量大小在29kD的热修饰蛋白在碳青霉烯类抗生素的耐药性中起作用。在鲍曼不动杆菌中发现AdeABC主动外排泵系统,它属于RND家族,近来的研究认为它在细菌对氨基糖甙类抗生素,氯霉素,甲氧苄胺嘧啶,氟喹诺酮类等抗生素的耐药机制中起作用,但是在对碳青霉烯类抗生素的耐药中是否起作用尚不确定。目前不动杆菌的基因分型方法有很多种,包括核酸分型、脉冲场凝胶电泳、随机扩增多态性DNA、扩增片段长度多态性分析。其中脉冲场凝胶电泳(PFGE)是分型方式中的“金标准”,目前已不仅仅是研究手段,还作为临床菌株常规流行病学工具,发展了同种细菌的分型工具。本研究对南方医院05年至08年临床收集的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的菌株进行研究,首先用多重PCR技术快速鉴定出鲍曼不动杆菌菌株,然后从外排泵、外膜蛋白、碳青霉烯类酶几个方面探索其耐药机制,并对其进行分子流行病学分析和研究;所涉及的统计学分析和处理采用SPSS 13.0软件。第一部分多重PCR方法进行鲍曼不动杆菌的快速鉴定研究目的:鲍曼不动杆菌是院内感染的重要致病因素,快速鉴定有利于及时治疗感染和预防暴发流行.本研究建立多重PCR实验技术快速鉴定鲍曼不动杆菌,同时为之后的实验做准备。方法:本研究建立了多重PCR实验技术,设计一对特异性引物直接鉴定鲍曼不动杆菌,同时设计的另一对不动杆菌的通用引物亦可以鉴定不动杆菌菌属;2对引物放入一个反应体系中进行PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果:多重PCR分析南方医院临床分离的170株鲍曼不动杆菌及鲍曼-醋酸钙不动杆菌的结果表明,整个过程所需时间约2小时左右。每一株菌株都扩增出对应于recA基因的分子量大小约为425bp的片段序列,即能确定是属于不动杆菌属;其中138株扩增出片段大小约为208bp对应于16sRNA基因的间隔区域(ITS)的片段序列,可确认为鲍曼不动杆菌,32株未扩增出此序列的则应该是醋酸不动鲍曼不动杆菌复合体中其他不动杆菌。同时行阴性对照菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单孢菌等11只菌株的多重PCR实验,结果显示未扩增出任何一个目的片段,均为阴性结果。无扩增产物。结论:本实验结果表明,多重PCR技术可以较好地对鲍曼不动杆菌进行鉴别,并能在2小时左右完成试验,该技术为鲍曼不动杆菌的快速鉴定提供了又一可供选择的手段,今后可以拓展对临床菌株的快速鉴定,有利于及时有效的治疗和院感控制暴发流行。第二部分耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌外排泵adeABC研究目的:外排泵系统是革兰氏阴性杆菌耐药的重要机制之一,而在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制中是否起作用尚存在分歧。本研究从外排泵表型和基因型两个方面论证外排泵系统在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制中所起的作用。方法:1.本研究通过主动外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)对138株鲍曼不动杆菌的外排泵进行了检测,主动外排泵表型检测的阳性标准是加主动外排泵抑制剂后美洛培南的最小抑菌浓度降低至少四倍以上;2.选取61株鲍曼不动杆菌菌株,用荧光定量PCR测定了外排泵adeABC在61株菌中的表达情况。明晰外排泵在对碳青霉烯类抗生素的耐药机制中是否起作用;外排泵adeABC在该类抗生素的耐药机制中是否起作用。统计学分析分别采用卡方检验和t检验,p＜0.05有统计学差异。结果:1.泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)和美罗培南协同实验的结果显示:使用CCCP之后,138株临床分离菌中,CCCP抑制实验共筛选出泵阳性菌株28株,其中对美罗培南耐药的39株菌中有15株即38.4%的菌株的MIC降低了4倍或以上,为泵阳性株;对美罗培南敏感的99株菌中有13株即13.1%的菌株的MIC降低了4倍或以上,为泵阳性株。经卡方检验统计学分析,差异有显著意义。(x~2=12.477~b,P=0.01);2.荧光定量PCR检测菌株的AdeB和16s rRNA后,根据检测结果计算出各标本的AdeB和16s rRNA的拷贝数,然后计算出表达量差异。经t检验统计学分析结果显示碳青霉烯类抗生素敏感组的AdeB的表达量是0.8991±1.17239,耐药组的表达量是21.1010±21.44315,敏感组的表达量显著低于耐药组的表达量,差异有统计学意义。(t=4.403,P=0.000)结论:提示主动外排泵机制在南方医院临床分离的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制中起作用。AdeB基因或者AdeABC外排泵机制可能在南方医院临床菌株对碳青霉烯类抗生素的耐药机制中起作用。第三部分耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO机制研究目的:本研究在基因表达和蛋白表达两个水平上检测鲍曼不动杆菌的外膜蛋白CarO在耐药菌和敏感菌中表达量的差别,以明晰外膜蛋白CarO是否参与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的机制。方法:基因表达水平用荧光定量PCR技术对外膜蛋白carO基因进行表达量的检测;蛋白表达水平的研究通过先制备和纯化膜蛋白CarO的多克隆抗体,再利用western bloting技术对临床收集的菌株进行外膜蛋白CarO的检测,蛋白表达量用灰度值计算。统计学分析采用t检验。结果:1.根据荧光定量PCR的检测结果计算出各标本的carO和16s rRNA的拷贝数,然后计算出表达量差异。统计学分析结果显示碳青霉烯类抗生素敏感组的carO的表达量为0.39±0.612,耐药菌的carO的表达量为2.98±3.463,敏感菌carO的基因表达量显著低于耐药组carO的表达量,差异有显著的统计学意义;2.成功制备外膜蛋白CarO的多克隆抗体;western blot结果显示用灰度值比较敏感菌和耐药菌外膜蛋白CarO表达量,t检验结果显示敏感菌外膜蛋白CarO表达量为717.515±395.84,耐药菌外膜蛋白CarO表达量为255.1033±23.26767,统计学分析有显著差异。(t=2.857,P=0.001)结论:carO基因水平表达敏感菌表达量比耐药菌表达量低,而蛋白水平表达CarO敏感菌表达量比耐药菌表达量则高。可能的猜测是是否外界环境或其他因素比如药物作用对耐药菌的菌体产生了某种影响,使细菌的转录水平RNA不能正常地进入翻译的步骤进行正常的翻译,从而形成堆积。而敏感菌则由于外界环境未受影响,转录水平RNA可以正常地进入翻译状态。第四部分耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶OXA研究目的:本研究尝试使用多重聚合酶链反应即多重PCR的实验技术,将所收集的96株鲍曼不动杆菌菌株进行OXA基因的检测,区分鉴定编码碳青霉烯类酶的四个OXA亚群的等位基因,从而研究各OXA类碳青霉烯类酶在临床菌株的分布状况。方法:通过设计OXA个亚群基因的多对引物,放入一个PCR反应体系中进行聚合酶链扩增反应。结果:本实验研究显示96株鲍曼不动杆菌中,只携有OXA-51的耐药菌有9株,敏感菌有33株;同时携有OXA-51和OXA-58两个基因的耐药菌株有38株,敏感菌株有6株;同时携有OXA-51和OXA-23的耐药菌和敏感菌各1株;8株菌未扩增出OXA基因;未有单纯携带OXA23和OXA58的菌株。结论:本研究结果显示在近三年南方医院的临床菌株中,耐药机制中OXA-51协同OXA-58起主要作用;与以往国内的相关研究结果有比较大的差异,可能的原因是区域和收集菌株时间的不同造成了携带OXA基因的差异。第五部分南方医院鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳分析目的:本研究以南方医院05年-08年临床分离的鲍曼不动杆菌为研究对象,进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析,分析近三年南方医院临床分离的鲍曼不动杆菌的基因分型和分布情况,为鲍曼不动杆菌的分子流行病学研究和流行病学暴发流行控制提供基础。方法:采用脉冲场凝胶电泳对临床分离的138株鲍曼不动杆菌进行分子流行病学研究,确认这些菌株的亲缘关系,并对临床暴发流行分析。PFGE条带判定结果的解释:通过目测判定其带型之间的关系,按照以下原则:(1)大多数流行病学相关带型大小和数量相近的菌株被认为是同一菌株(主流型),称为A型(2)由于突变、插入、缺失或倒置的基因改变在带型上有与主要表型有1-3个差别的菌株被认为是主要型中的亚型,分别称为A1、A2、A3;(3)带型上有4或4个以上的不同之处,不能用1次或2次基因变化来解释的,被认为是不同的菌株,分别称为B、C、D。结果:根据脉冲场凝胶电泳分析,138株鲍曼不动杆菌中有87株属于同一菌株(主流型),我们将之称为A克隆,时间跨度上从05年的菌株到08年的菌株都有该型;并且分布在不同的科室之间;其中条带完全相同的有45株菌,条带差异1-3条的有A1-A3克隆株有42株菌;B克隆有18株;C克隆有9株;散发菌株约24株。结论:我院各临床科室存在鲍曼不动杆菌以及碳青酶烯类抗生素的鲍曼不动杆菌菌株的流行,同时也存在散发分布。耐药克隆株的传播流行是造成耐亚胺培南鲍曼不动杆菌增加的主要原因。应该采取有效措施控制鲍曼不动杆菌的传播;密切监测耐药株的变迁和发展趋势,是防止和延缓鲍曼不动杆菌耐药和暴发流行的必要措施。