【摘 要】
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研究目的:血管内皮细胞中的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的异常聚集是动脉粥样硬化病变的主要病理变化之一。Humanin(HN)是一种机体内源性小分子多肽。我们前期研究表明,外源性给予S14G-HN(HNG)可以通过抑制入胞,促进外排,减少ox-LDL在血管内皮细胞的聚集,本研究旨在讨论HNG对ox-LDL在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中自噬性降解的作用,并讨论其作用是否通过细胞膜受体FPRL
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研究目的:血管内皮细胞中的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的异常聚集是动脉粥样硬化病变的主要病理变化之一。Humanin(HN)是一种机体内源性小分子多肽。我们前期研究表明,外源性给予S14G-HN(HNG)可以通过抑制入胞,促进外排,减少ox-LDL在血管内皮细胞的聚集,本研究旨在讨论HNG对ox-LDL在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中自噬性降解的作用,并讨论其作用是否通过细胞膜受体FPRL1实现。材料与方法:不同浓度Dil标记的氧化型低密度脂蛋白(Dil-ox-LDL)(0、30 μg/ml、60μg/ml、90 μg/ml、120 μg/ml)以及不同浓度的 HNG(0、100 nM、1 μM、10 μM)与HUVECs共培养12 h,采用流式细胞仪观察HUVECs中外源给予Dil-ox-LDL对细胞内脂质聚集情况,预处理不同浓度HNG对HUVECs中Dil-Ox-LDL聚集的影响;不同浓度的ox-LDL以及不同浓度的HNG与HUVECs共培养12 h,CCK8检测ox-LDL和HNG对HUVECs活力影响;采用膜蛋白提取试剂盒提取细胞质膜总蛋白,western blot检测膜蛋白FPRL1的表达;QPCR检测细胞 B、B、D、K、L mRNA 表达水平;western blot 用来检测 ox-LDL和HNG对HUVECs中的自噬关键蛋白p62、LC3-Ⅱ以及溶酶体酶Cathepsin D蛋白表达影响;溶酶体酶活性试剂盒检测溶酶体酶Cathepsin D活性;细胞脂质比色法定量检测试剂盒检测细胞胆固醇表达情况;免疫荧光检测HN在HUVECs中表达。结果:1.Dil-ox-LDL(0、30 μg/ml、60 μg/ml、90 μg/ml、120 μg/ml)浓度依赖性在HUVECs中聚集;CCK8结果显示当ox-LDL的浓度达到90 μg/ml、120μg/ml明显降低细胞活力增加细胞死亡;Ox-LDL呈浓度依赖性增加HUVECs中p62、LC3-Ⅱ蛋白表达。2.免疫荧光结果显示在HUVECs中内源性HN有表达;Ox-LDL能够时间和浓度依赖性改变HUVECs中内源HN mRNA的表达;CCK8结果显示不同浓度HNG(0、100 μM、1 μM、10μM)对细胞活力无影响;HNG呈浓度依赖性降低HUVECs中由ox-LDL诱导的p62蛋白和脂质聚集增加,增加LC3-Ⅱ蛋白的表达。3.Ox-LDL 浓度依赖性增高 HUVECs 中 Cathepsin B,Cathepsin K,Cathepsin L mRNA转录水平的表达,降低Cathepsin D mRNA水平;Ox-LDL浓度依赖性降低Cathepsin D蛋白表达以及酶活性;Ox-LDL对HUVECs中Lamp 1蛋白表达量无影响;HNG浓度依赖性修复由ox-LDL诱导的Cathepsin D功能损伤;BAF-A1预处理HUVECs阻断细胞自噬流,HNG不能降低细胞内Dil-ox-LDL的聚集。4.Ox-LDL对FPRL1蛋白表达水平无影响;FPRL1 siRNA转染HUVECs,阻断FPRL1基因,HNG不能降低HUVECs中脂质的聚集;使用FPRL1 siRNA或者FPEL1特异性拮抗剂Boc-MLF处理HUVECs阻断FPEL1途径,HNG缓解自噬流障碍以及修复溶酶体酶Cathepsin D功能的作用消失。结论:Humanin可以通过FPRL1修复HUVECs中溶酶体Cathepsin D酶活性以及蛋白水平从而修复被ox-LDL诱导的溶酶体功能损伤,进一步修复了HUVECs中被ox-LDL诱导的自噬流损伤,促进脂质在HUVECs中通过自噬溶酶体途径降解。
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