骨髓间充质干细胞(Bone MesenchymalStem Cells,BMSCs)是一种来自骨髓的多能干细胞,自我更新能力强,具有多向分化的潜能。体内正常生长或体外定向诱导培养条件下,它可以向成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞和肌肉细胞分化。骨髓间充质干细胞的临床应用包括骨缺损,软骨退化的治疗,肝脏、心脏等组织修复,新陈代谢相关疾病治疗。在再生医学与组织工程中其临床应用价值很高。骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化有两条主要的调控途径,分别是TGF-β/BMPs信号通路和经典Wnt信号通路。Bmp2作为BMPs家族中一个重要的亚型,它与来自Wnt信号通路中的β-catenin都具有上调向成骨细胞分化的关键基因Runx2,Osterix表达的功能,从而促进向成骨细胞分化。Mof即KAT8,作为组蛋白乙酰转移酶MYST家族的成员,它具有MYST催化结构域。大多数组蛋白乙酰转移酶家族往往随机对组蛋白尾部赖氨酸进行乙酰化,Mof对组蛋白H4第16位的赖氨酸具有严格的底物特异性。Mof在许多以染色质为基础的生命活动中发挥调控作用,如胚胎发育、细胞分化、DNA损伤修复以及肿瘤发生。骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的这一过程,组蛋白乙酰化调控发挥着重要功能。成骨分化相关蛋白Runx2在向成骨细胞分化进程中表达升高,这与H3K9的乙酰化修饰和H3K14的乙酰化修饰有关。HDAC8可以抑制H3K9乙酰化和Runx2活性,抑制成骨分化。组蛋白白去乙酰化酶抑制剂可以促进向成骨细胞分化。了解Mof在向成骨细胞分化过程中发挥的作用将有重要的研究意义与临床实用价值。研究目的:我们利用小鼠骨髓间充质干细胞ST2细胞,前成骨细胞MC3T3-E1细胞诱导向成骨细胞分化,分别通过碱性磷酸酶染色实验,茜素红染色实验验证,研究Mof在向成骨细胞分化过程中的表达变化情况。我们利用siRNA干扰Mof表达后,观察向成骨细胞分化是否受到抑制。利用Western Blotting实验和定量PCR(Q-PCR)技术检测干扰Mof表达和过表达Mof后,Bmp2、β-catenin、Runx2、Osterix的蛋白和RNA的表达变化情况。免疫共沉淀(Co-IP)实验探究Mof和向成骨细胞分化相关蛋白之间的相互作用。研究方法:1.配制诱导向成骨细胞分化培养基培养ST2细胞,MC3T3-E1细胞从而诱导向成骨细胞分化,利用碱性磷酸酶染色实验以及茜素红染色实验进行验证。利用 Western Blotting 技术检测 Mof、H4K16ac 以及 Bmp2、β-catenin、Runx2和Osterix在诱导向成骨细胞分化0天,3天,7天和14天的蛋白表达变化情况。2.在ST2细胞,MC3T3-E1细胞中利用siRNA干扰Mof的表达,观察向成骨细胞分化是否在Mof的表达降低时受到抑制,利用WesternBlotting实验和 Q-PCR 实验观察 Bmp2、β-catenin、Runx2 和 Osterix 等在 Mof 表达降低时的表达变化。3.在ST2细胞,MC3T3-E1细胞中,瞬时转染Flag-Mof质粒,研究在过表达 Mof 时,Bmp2、β-catenin、Runx2 和 Osterix 的表达变化。4.利用Co-IP实验方法观察正常培养和诱导向成骨细胞分化培养情况下ST2细胞,MC3T3-E1细胞中,Mof与Runx2、Osterix和β-catenin的相互作用关系。5.在全身敲除Mof的转基因小鼠模型中,利用HE染色方法观察骨组织形态结构的变化。实验结果:1.ST2细胞,MC3T3-E1细胞经诱导向成骨细胞分化后,Mof蛋白的表达水平,H4K16乙酰化水平随着天数增加逐渐升高。Bmp2、β-catenin、Runx2、Osterix的蛋白表达也升高。2.利用siRNA干扰Mof的表达后,向成骨细胞分化受到抑制。Bmp2、β-catenin的表达没有明显变化,Runx2、和Osterix的表达降低。3.过表达Mof后,Runx2和Osterix的蛋白表达升高。4.Co-IP实验证明,Mof并不与β-catenin相互作用,但是和Runx2、Osterix相互作用。5.小鼠个体水平的研究发现,全身敲除Mof后,骨组织形态结构并没有明显变化,可能诱导天数较短,表型变化并不明显。结论:向成骨细胞分化过程中,Mof蛋白表达量升高。干扰Mof表达造成向成骨细胞分化受到抑制。Mof可以与Runx2、Osterix在蛋白水平上相互作用。实验结果证明向成骨细胞分化这一过程中Mof具有重要的调控作用。