‘砀山酥梨’及其褐皮芽变果皮中PbCYP86A1/B1的克隆及功能验证

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‘砀山酥梨’(Pyrus bretshneideri cv.Dangshansuli)的果皮呈黄绿色,但其芽变品系‘锈酥’却全面着褐色。前期研究结果表明,果皮木栓质形成与梨果皮褐色性状密切相关。通过对“砀山酥梨”及其褐皮芽变‘锈酥’果皮色泽形成关键期的果皮转录组进行分析,筛选出与木栓质生物合成的相关基因。本研究利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)对相关基因进行了表达分析,鉴定出与木栓质形成相关的差异表达基因PbCYP86A1、PbCYP86B1。获得两个基因序列后,采用TRV介导的VIGS技术,在梨果实中建立的病毒诱导基因沉默技术,分析基因沉默后梨果皮色差、质地、木栓质组分和基因表达,研究其与‘砀山酥梨’褐皮芽变形成的关系,主要结果如下:(1)通过对木栓质合成途径的P450家族关键基因进行差异性表达分析,我们发现:在转色期后,PbCYP86A1、PbCYP86B1在‘锈酥’果皮中表达量高于‘砀山酥梨’中的表达量,并存在显著差异。(2)采用农杆菌为介导转化洋葱表皮细胞,结果表明PbCYP86A1和PbCYP86B1基因定位在细胞膜。(3)与空载对照相比,PbCYP86A1和PbCYP86B1基因沉默‘锈酥’梨果实,在发育过程中,注射部位的木栓质层无法正常积累,表现为黄绿色;未注射部位覆盖木栓质,表现为褐色。沉默PbCYP86A1基因的梨果皮部位色差值大约是对照组的4倍,沉默PbCYP86B1基因的梨果皮部位色差值是对照组的3.5倍左右。石蜡切片结果表明,沉默PbCYP86A1和PbCYP86B1基因的梨果皮表层细胞木栓质程度与对照相比均明显降低。PbCYP86A1和PbCYP86B1基因沉默均能显著抑制梨果皮中C16ω-羟基脂肪酸和C16α,ω-二酸的合成,从而使木栓质总量减少。qRT-PCR结果表明,与对照梨果实相比,沉默PbCYP86A1和PbCYP86B1基因的注射梨果皮部位,两个基因表达量明显降低,达到显著性差异水平。
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