在能源的可持续发展进程中,可再生的新能源逐渐替代化石类能源将是历史发展的必然。而作为众多新能源的成员之一,生物质能是一种绿色生物将太阳能转化为化学能,进而贮存于生物体内的能源物质,包括植物木质纤维素或海洋藻类等具有生物转化产能（如生物燃料）的有机物资源。作为发展潜力巨大的生物燃料成员之一,生物丁醇以其较高的热能值、低挥发度、低腐蚀性等优势,被认为是继生物乙醇之后替代化石燃料的另一最佳选择。传统的生物丁醇生产方式是以产溶剂梭菌为出发菌株,通过丙酮-丁醇-乙醇（ABE）代谢途径经过厌氧发酵进行。然而,这个生产过程始终面临着原料成本高、丁醇产率低且副产物占比高等问题,这些均严重阻碍了生物丁醇的工业化生产进程。因而现阶段比较迫切的任务是建立和完善一种经济且高效的产醇发酵体系,在提高丁醇产量并降低生产成本的同时,也为后续生物丁醇的真正落地与工业化提供理论与实践基础。基于此,本论文主要围绕一株高产丁醇的梭菌菌株Clostridium sp.WK开展相关工作,在分析不同发酵方式对丁醇产量影响的同时,以半乳糖为底物,分析和挖掘菌株WK在代谢半乳糖过程中的关键基因,最终通过对这些基因的过表达,不仅促进了菌株对底物的利用,也进一步提升其转化丁醇的能力。具体工作包括:1)对菌株WK在分批发酵和补料分批发酵等不同发酵条件下的发酵性状进行探索。结果发现,在补料分批发酵的条件下,菌株WK最多消耗了30 g/L葡萄糖,丁醇产率最高能够达到0.454 g/g;而分批发酵的条件下,菌株虽然能消耗高达40 g/L葡萄糖,但是丁醇产率却有所下降（0.372 g/g）。这一现象说明了采用低浓度补料分批发酵的方式有利于降低菌株发酵过程中的能量损耗,从而提升生物丁醇的转化率。2)为解决菌株WK在半乳糖代谢过程中效率稍低的问题,进一步通过实时定量PCR（RT-q PCR）的方式对半乳糖代谢通路（Leloir Pathway）上的相关基因进行转录水平分析,以期全面了解菌株在半乳糖利用过程中的调控过程。结果显示,菌株WK中的半乳糖代谢途径可分为两部分:包括由基因gal M、gal K和gal T组成的“主路”和由其他基因组成的“支路”,并且不同基因的表达水平在不同时间段存在较大差异。最终,我们也获取了调控半乳糖利用的两个关键基因:gal K（编码半乳糖激酶）和gal T（编码已糖-1-磷酸尿苷酰转移酶）。3)在获得半乳糖代谢关键基因gal K和gal T的基础上,通过构建以穿梭质粒p MTL83353为骨架的梭菌特异性过表达载体,实现了这两个关键基因的在菌株WK中的过表达。分批发酵结果显示,与原始菌株相比,工程菌WK::gal K的半乳糖消耗量达到了34 g/L,较野生菌提升了33.2%,丁醇及ABE产量分别为11.53 g/L和16.32 g/L,比野生菌分别提升了47.4%和40.5%;工程菌WK::gal T的半乳糖消耗量达到了31 g/L,提升了22.7%,丁醇及ABE产量分别为9.81 g/L和14.55 g/L,分别提升了25.6%和25%;而共表达菌株WK::gal K+gal T的半乳糖消耗量仅提升了8.7%（27 g/L）,其丁醇及ABE产量也只提升了11.5%（8.7 g/L）和4.3%（12.14 g/L）。因此,我们通过更换启动子的方式对共表达载体p MTL83353-gal K+gal T进行了优化,优化后的工程菌WK::gal K+gal T-2(Pfdx)拥有更优越的发酵性能,其半乳糖消耗量达到了38.35g/L,较野生菌提升了49.9%,丁醇及ABE产量分别达到了12.36 g/L和17.18g/L,与野生菌相比分别提升了57.7%和47.4%;总的来说,本论文主要围绕产溶剂梭菌Clostridium sp.WK的底物利用机制开展研究,通过发酵方式、转录水平分析和基因过表达等方式优化并促进梭菌菌株利用底物转化生物丁醇。相关成果不仅展示了菌株WK自身巨大工业应用价值,也为海藻生物质特别是富含半乳糖的红藻多糖的利用及实现其生物丁醇高效转化的过程提供了理论和实践基础。