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背景及目的:
胃癌5年生存率仅占20%左右。Tetraspanins是一类四跨膜蛋白超家族,在细胞中发挥着信号转导、增殖、运动、粘附、免疫应答等多种生物学功能。TSPAN9是四跨膜蛋白超家族成员中的一员,我们前期研究观察到,TSPAN9在耐药胃癌样品中表达水平增加,TSPAN9的高表达与胃恶性肿瘤不良预后有关,但具体分子机制尚不清楚。本研究拟在体外细胞水平上,探讨和研究高表达的TSPAN9对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响及可能的作用机制。
方法:
构建携带TSPAN9基因及空载体的重组质粒,根据LIP3000说明书,将构建好的携带TSPAN9基因及空载体的重组质粒,转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,从而分成TSPAN9过表达转染组及空载体组,同时培养SGC7901(空白组)。即SGC7901/TSPAN9(转染组)、SGC7901/NC(对照组)、SGC7901(空白组)。转染6小时后,分别给予亚毒性剂量的5-FU(10 μg/mL),继续培养,24h或48h后收集细胞,分别提取RNA、蛋白质。应用qRT-PCR和Western-Blot技术分别在mRNA及蛋白水平验证TSPAN9过表达、检测细胞中促凋亡指标(Bax、Caspase-3)、抑凋亡指标(Bcl-2、Mcl-1)以及通路蛋白(β-catenin、GSK-3β、Axin1、Dvl2)。应用流式细胞术检测细胞早期及晚期凋亡情况。
结果:
SGC7901/TSPAN9转染组TSPAN9在mRNA及蛋白质水平均高表达。在10μg/mL 5-FU干预条件下,qRT-PCR和Western-Blot实验中,SGC7901/TSPAN9转染组促凋亡指标(Bax、Caspase-3)明显降低,抑凋亡指标(Bcl-2、 Mcl-1)明显升高,同时在流式细胞术实验中,与对照组相比较,SGC7901/TSPAN9组细胞总凋亡率明显降低。在通路机制研究中,TSPAN9组Wnt通路相关蛋白(β-catenin、GSK-3β、Axin1、 Dvl2)也是明显升高的,P<0.05。
结论:
在胃癌细胞中,过表达的TSPAN9激活Wnt/β-catenin信号通路,通过调节与凋亡增殖(Bcl-2、Bax、Caspase-3、Mcl-1)相关指标中Bcl-2、Mcl-1的上调,以及下调Bax、Caspase-3,进而参与调控胃癌细胞的凋亡,降低胃癌细胞株SGC7901细胞对5-FU的敏感性,使细胞产生耐药,最终影响胃癌的发展。
胃癌5年生存率仅占20%左右。Tetraspanins是一类四跨膜蛋白超家族,在细胞中发挥着信号转导、增殖、运动、粘附、免疫应答等多种生物学功能。TSPAN9是四跨膜蛋白超家族成员中的一员,我们前期研究观察到,TSPAN9在耐药胃癌样品中表达水平增加,TSPAN9的高表达与胃恶性肿瘤不良预后有关,但具体分子机制尚不清楚。本研究拟在体外细胞水平上,探讨和研究高表达的TSPAN9对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响及可能的作用机制。
方法:
构建携带TSPAN9基因及空载体的重组质粒,根据LIP3000说明书,将构建好的携带TSPAN9基因及空载体的重组质粒,转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,从而分成TSPAN9过表达转染组及空载体组,同时培养SGC7901(空白组)。即SGC7901/TSPAN9(转染组)、SGC7901/NC(对照组)、SGC7901(空白组)。转染6小时后,分别给予亚毒性剂量的5-FU(10 μg/mL),继续培养,24h或48h后收集细胞,分别提取RNA、蛋白质。应用qRT-PCR和Western-Blot技术分别在mRNA及蛋白水平验证TSPAN9过表达、检测细胞中促凋亡指标(Bax、Caspase-3)、抑凋亡指标(Bcl-2、Mcl-1)以及通路蛋白(β-catenin、GSK-3β、Axin1、Dvl2)。应用流式细胞术检测细胞早期及晚期凋亡情况。
结果:
SGC7901/TSPAN9转染组TSPAN9在mRNA及蛋白质水平均高表达。在10μg/mL 5-FU干预条件下,qRT-PCR和Western-Blot实验中,SGC7901/TSPAN9转染组促凋亡指标(Bax、Caspase-3)明显降低,抑凋亡指标(Bcl-2、 Mcl-1)明显升高,同时在流式细胞术实验中,与对照组相比较,SGC7901/TSPAN9组细胞总凋亡率明显降低。在通路机制研究中,TSPAN9组Wnt通路相关蛋白(β-catenin、GSK-3β、Axin1、 Dvl2)也是明显升高的,P<0.05。
结论:
在胃癌细胞中,过表达的TSPAN9激活Wnt/β-catenin信号通路,通过调节与凋亡增殖(Bcl-2、Bax、Caspase-3、Mcl-1)相关指标中Bcl-2、Mcl-1的上调,以及下调Bax、Caspase-3,进而参与调控胃癌细胞的凋亡,降低胃癌细胞株SGC7901细胞对5-FU的敏感性,使细胞产生耐药,最终影响胃癌的发展。