论文部分内容阅读
目的： 利用LPS建立小鼠肝脏急性炎症和RAW264.7巨噬细胞系炎症模型，通过动物实验和细胞实验探讨miR-155是否通过影响其靶基因GSK-3β调控NF-κB信号通路，以及竹节参皂苷Ⅳa是否通过调控miR-155发挥抗炎作用。 方法： (1)LPS刺激RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症模型，Greiss试剂法和ELISA法检测细胞上清NO，TNF-α和IL-1β分泌以及qRT-PCR法检测细胞miR-155表达。瞬时转染miR-155模拟物、抑制物以及GSK-3βsiRNA，qRT-PCR法检测miR-155、iNOS、TNF-α和IL-1β mRNA表达；Western blot法检测GSK-3β和NF-κB p65蛋白表达，明确miR-155/GSK-3β/NF-κB信号通路是否参与巨噬细胞的活化作用。 (2)LPS刺激RAW264.7巨噬细胞及竹节参皂苷Ⅳa干预，明确竹节参皂苷Ⅳa是否可以抑制LPS诱导巨噬细胞的炎症作用及可能的分子机制。采用MTT法观察竹节参皂苷Ⅳa对RAW264.7细胞生长影响；采用Greiss试剂法检测NO释放量；ELISA法检测细胞上清TNF-α和IL-1β分泌；qRT-PCR法检测细胞miR-155、CD14、TLR4、iNOS、TNF-α和IL-1β mRNA表达；免疫荧光分析胞质和胞核NF-κB p65；Western Blot技术检测细胞GSK-3β和NF-κB p65蛋白表达。瞬时转染miR-155模拟物及竹节参皂苷Ⅳa干预，qRT-PCR法检测细胞miR-155、iNOS、TNF-α和IL-1βmRNA表达以及Western blot法检测GSK-3β和NF-κB p65蛋白表达。瞬时转染GSK-3β siR-763及竹节参皂苷Ⅳa干预，ELISA法检测细胞上清TNF-α和IL-1β分泌以及Western blot法检测GSK-3β和NF-κB p65蛋白表达。 (3)利用LPS刺激小鼠建立肝脏炎症模型，采用竹节参皂苷Ⅳa预保护后，检测小鼠肝脏指数，ALT和AST；qRT-PCR法检测小鼠肝脏miR-155、GSK-3β、TNF-α、IL-1βmRNA表达；免疫组化法检测小鼠肝脏CD68蛋白表达。 结果： (1)LPS能显著提高RAW264.7细胞NO、TNF-α和IL-1β分泌量，诱导RAW264.7细胞大量表达miR-155；转染miR-155模拟物后，GSK-3β表达量显著减少，iNOS、TNF-α和IL-1βmRNA表达量显著增加，并呈良好的剂量依赖性，说明过表达miR-155能通过降低GSK-3β的表达而诱导炎性因子产生；转染miR-155抑制物后，GSK-3β表达量显著增加，iNOS、TNF-α和IL-1βmRNA表达显著降低，并呈良好的剂量依赖性，说明抑制miR-155能增加GSK-3β的表达而抑制LPS诱导的炎症反应。转染三种靶序列GSK-3βsiRNA后，发现GSK-3βsiR-763能显著降低GSK-3β表达，增加核蛋白NF-κB表达，增加TNF-α和IL-1β分泌，说明GSK-3β阻断了NF-κB信号通路。 (2)竹节参皂苷Ⅳa对RAW264.7巨噬细胞生长无影响；竹节参皂苷Ⅳa能显著抑制LPS致细胞NO、TNF-α和IL-1β释放量，且对CD14、TLR4、iNOS、TNF-α和IL-1βmRNA表达也有抑制效果；免疫荧光和Western Blot结果显示竹节参皂苷Ⅳa能增加GSK-3β表达，降低核蛋白NF-κB表达，减少NF-κB核易位。竹节参皂苷Ⅳa还能显著降低LPS诱导的miR-155表达；瞬时转染miR-155模拟物及竹节参皂苷Ⅳa干预后发现细胞GSK-3β表达量升高，核蛋白NF-κB表达量降低，且对iNOS、TNF-α和IL-1βmRNA表达也有抑制效果，提示竹节参皂苷Ⅳa可以拮抗过表达的miR-155对炎症反应的促进作用；瞬时转染GSK-3βsiR-763及竹节参皂苷Ⅳa干预后发现GSK-3β表达量升高，核蛋白NF-κB表达量降低，同时，竹节参皂苷Ⅳa对TNF-α和IL-1β分泌水平也有很好地抑制效果。 (3)竹节参皂苷Ⅳa能显著降低LPS引起的小鼠肝脏指数以及血清中ALT和AST含量，还能降低LPS诱导的肝炎CD68+巨噬细胞数量，对LPS致小鼠肝炎miR-155、GSK-3β、TNF-α和IL-1βmRNA表达水平也有显著的抑制作用，说明竹节参皂苷Ⅳa可以改善LPS所致小鼠肝脏炎症反应。 结论： 竹节参皂苷Ⅳa具有良好的抗炎效果，其抗炎作用机制可能与抑制miR-155的表达有关，miR-155通过抑制其靶基因GSK-3β的活性进而调控NF-κB信号通路从而促进炎症反应。