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一.研究目的
1.测定131I-Rituximab对CD20阳性的B细胞淋巴瘤细胞的体外生长抑制作用及诱导凋亡作用，探索131I-Rituximab抑制CD20阳性的B细胞淋巴瘤细胞生长的可能机制。
2.比较131I-Rituximab与单纯131I或Rituximab对CD20阳性的B细胞淋巴瘤细胞的作用差别，初步评价131I-Rituximab对B细胞淋巴瘤细胞的抗肿瘤活性。
3.为131I-Rituximab应用于难治复发性B细胞非何杰金淋巴瘤的动物实验、临床试验及临床治疗，提供更广泛、更精确的实验基础和理论依据。
二.实验方法
1.以CD20阳性的淋巴瘤细胞株Ramos(RA-1)细胞及Raji细胞作为实验细胞，以CD20阴性的T淋巴细胞系Molt-4细胞作为对照细胞。测量三种细胞的生长曲线并以流式细胞仪测定细胞表面CD20的表达率。
2.以流式细胞仪测定Rituximab的结合抑制率，用IODO-GEN法对Rituximab进行131I标记。以细胞结合分析法评价131I-Rituximab与戊二醛固定后的上述细胞的结合能力，以间接ELISA法测定Rituximab标记前后的免疫活性。
3.以MTT比色法测定131I-Rituximab、131I和Rituximab对Raji细胞的剂量效应曲线。并根据剂量效应曲线选取合适的剂量，以131I-Rituximab、131I及Rituximab作用于CD20阳性的Ramos(RA-1)细胞和Raji细胞以及CD20阴性的Molt-4细胞，根据细胞形态和存活率的变化，评价131I-Rituximab、131I及Rituximab对上述细胞的杀伤作用。Gimesa染色观察核分裂指数(MI值)等指标评价131I-Rituximab对Raji细胞的抗肿瘤活性。
4.将比活度为60μCi/ml的131I-Rituximab、131I和100μg/ml的Rituximab分别加入1×106/ml的Raji细胞中，对照组只加入等量完全培养液。作用24小时后用AnnexinV-FITC/PI双染法测定细胞的凋亡指数，以PI染色法检测131I-Rituximab作用后Raji细胞的细胞周期分布。
三.结果
1.淋巴瘤细胞株Raji细胞表面CD20的表达率为93.27％，Ramos(RA-1)细胞为94.04％，Molt-4细胞为0.67％。对数生长期三种细胞的存活率均＞95％。Raji、Ramos(RA-1)、Molt-4细胞固定后与131I-Rituximab的结合率分别为26.08％±1.87％、21.46％±2.61％、16.86％±1.34％，固定后Molt-4细胞与131I-Rituximab的结合率显著低于Raji细胞(P＜0.001)及Ramos(RA-1)细胞(P=0.003)。
2.细胞表面CD20抗原结合抑制率结果显示，Raji细胞表面CD20抗原表达率仅剩1.19％，抑制率达98.81％，Ramos(RA-1)细胞CD20表面抗原表达率仅剩3.18％，抑制率达96.82％。
3.间接ELISA法测定Rituximab标记前后免疫活性显示，抗体浓度在0.49μg/ml～1000μg/ml时，对应RituximabA492值为0.154～1.379，131I-Rituximab的A492值为0.160～3.300，即两组的A492值随着抗体浓度增高而增高。经统计学分析，Rituximab组抗体浓度与A492值相关度高，R2=0.985，F=170.390，P＜0.001，表明抗体浓度(1g)与A492值之间呈显著正相关。A492值(Y)与抗体浓度(1gX)之间的数量关系为：Y=0.151+0.084X-0.190X2+0.975X3。131I-Rituximab组抗体浓度与A492值相关度高，R2=0.966，F=74.770，P＜0.001，表明抗体浓度(1g)与A492值之间呈显著正相关。A492值(Y)与抗体浓度(1gX)之间的数量关系为：Y=0.028-0.704X+1.336X2-0.237X3。
4.131I-Rituximab对Raji细胞的杀伤作用呈剂量依赖性。131I-Rituximab、131I比放射性活度从970μCi/ml～7.6μCi/ml、Rituximab有效浓度1000μg/ml～7.8μg/ml区间内，131I-Rituximab组对Raji细胞的杀伤作用显著强于Rituximab组(P＜0.001)。根据剂量效应曲线，选取60μCi/ml作为疗效实验的作用剂量，结果发现：①131I-Rituximab对Raji细胞的抑制率最高，为47.12％±7.65％，单纯131I组抑制率为39.06％±6.09％，单纯Rituximab组的抑制率为12.48％±7.16％。131I-Rituximab组的细胞抑制率显著高于Rituximab组(P＜0.001)。Rituximab组未见明显死亡细胞，但在光镜下可见细胞核颗粒明显增多，细胞生长状态明显比无干扰条件下的细胞生长状态差；②Raji细胞与Ramos(RA-1)细胞在131I-Rituximab作用24小时后的细胞抑制率分别为47.12％±7.65％、44.04％±8.60％，两组细胞间无显著性差异(P=0.555)。Raji细胞与Ramos(RA-1)细胞在131I作用24小时后的细胞抑制率分别为39.06％±6.09％、37.08％±3.51％，两组细胞间无显著性差异(P=0.567)。Raji细胞与Ramos(RA-1)细胞在Rituximab作用24小时后的细胞抑制率分别为12.48％±7.16％、9.64％±2.27％，两组细胞间无显著性差异(P=0.356)；③Raji细胞与Molt-4细胞在131I-Rituximab作用24小时后的细胞抑制率分别为47.12％±7.65％、16.76％±7.75％，Raji细胞显著高于Molt-4细胞(P＜0.001)。Raji细胞与Molt-4细胞在131I作用24小时后的细胞抑制率分别为39.06％±6.09％、6.52％±5.97％，Raji细胞显著高于Molt-4细胞(P＜0.001)。Raji细胞与Molt-4细胞在Rituximab作用24小时后的细胞抑制率分别为12.48％±7.16％、4.70％±3.02％，Raji细胞显著高于Molt-4细胞(P=0.022)；④131I-Rituximab作用后的Raji细胞空泡样变性，核碎裂，细胞膜破裂，为坏死改变。个别细胞体积缩小，胞浆浓缩，核固缩，细胞膜皱缩，呈凋亡样改变；⑤MI值检测结果表明，131I-Rituximab的MI值最低，为4.30％±1.50％，Rituximab组为25.90％±2.20％，131I组为24.60％±2.45％，对照组为29.20％±1.90％。
5.131I-Rituximab、131I和Rituximab分别与Raji细胞作用24小时后，131I-Rituximab组凋亡率为51.93％±1.62％，131I组为42.33％±1.17％，Rituximab组为29.34％±1.34％，对照组为26.27％±0.78％。对照组和Rituximab组凋亡率显著低于131I-Rituximab组(F=264.710，P＜0.001)。晚期凋亡细胞提示：131I-Rituximab组晚期凋亡细胞占9.90％±1.25％，显著多于对照组1.40％±0.41％(P＜0.001)、Rituximab组1.90％±0.20％(P＜0.001)，凋亡细胞各组间差异有统计意义(F=86.032，P＜0.001)。
6.DNA直方图显示，131I-Rituximab组凋亡率(亚二倍体峰)为4.34％±0.81％，131Ⅰ组为1.50％±0.17％，Rituximab组为1.38％±0.08％，对照组仅0.37％±0.02％。131I-Rituximab组凋亡率均显著高于对照组、131I组和Rituximab组(F=51.193，P＜0.001)。131I-Rituximab组截止于G1/G2期的比例为80.20％±1.61％，对照组截止于G1/G2期的比例为56.04％±1.58％，而131I组和Rituximab组截止于G1/G2期的比例分别为55.96％±1.76％和49.97％±0.97％，131I-Rituximab组显著高于其它各组(F=242.4，P＜0.001)。131I-Rituximab组处于M4期的比例为4.85％±0.30％，131I组、Rituximab组及对照组分别为28.64％±1.23％、37.64％±1.05％和30.40％±1.65％，提示131I-Rituximab组显著降低(F=447.031，P＜0.001)。
四.结论
采用IODO-GEN法制备的131I-Rituximab，其细胞结合能力及免疫活性高，131I-Rituximab与CD20阳性的B细胞淋巴瘤细胞具有很高的靶向特性。与131I及Rituximab比较，从细胞生长抑制率、凋亡率及作用后细胞周期的分布等方面评价，131I-Rituximab显示了更理想的抗肿瘤活性。这表明131I-Rituximab为导向放射免疫治疗CD20阳性的B细胞淋巴瘤提供可能性。