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炎症是机体对抗各种感染和损伤的一种防御性机制,但炎症失控会引起一系列的病理反应,如败血症、过敏反应、动脉粥样硬化、结肠炎等,甚至进展为癌症。间充质基质细胞(Mesencymal stromal cells,MSCs)不仅具有多向分化潜能、低免疫原性,还可调控多种免疫细胞的发育及功能,有望用于治疗炎症性疾病。MSCs已用于治疗脓毒症、结肠炎以及脑炎等疾病的研究,但是治疗效果存在差异。为了更好地利用这种细胞,需阐明MSCs如何调控炎症的机制。MSCs可以通过调控免疫细胞间接参与炎症反应。同时MSCs是炎症感受器,表面存在Toll样受体分子可感应炎症刺激信号,然后转导信号给免疫细胞,参与炎症相关的免疫应答。而MSCs是否能直接调控炎症应答并不完全清楚。炎症小体是炎症的关键信号之一,它属于细胞内蛋白复合物,可以分泌促炎因子、诱导细胞焦亡,在固有免疫和适应性免疫应答中发挥重要作用。炎症小体主要包括NLRP3、NLRC4、NLRP1、AIM2、NLRP2、NLRP6、NLRP7、NLRP12及IFI16等类型。NLRP3炎性小体可以被多种因素激活,对它的研究最为普遍。NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡蛋白(ASC)和pro-Caspase-1组成。NLRP3炎症小体能剪切pro-Caspase-1成p20/p10亚基,控制IL-1β和IL-18的成熟与分泌。IL-1β和IL-18具有极强的促炎活性,在炎症免疫应答中具有非常重要的作用。NLRP3炎症小体激活还可以诱导焦亡,导致细胞内容物的释放。近年来有研究报道了依赖于Caspase-4/5/11等非经典的炎性小体激活途径,这些炎症小体也能引起细胞焦亡,参与固有免疫应答。既往研究认为,炎症小体主要存在于巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等传统意义的免疫细胞中。但近期有研究结果显示,人脐血来源的MSCs在脂多糖(LPS)刺激下,其胞内NLRP3和Caspase-1的基因表达升高,本研究在前期试验中也发现骨相关MSCs中IL-1的转录水平较高,这些研究结果提示MSCs中可能存在炎症小体。在前期研究基础上,本研究分离、纯化和鉴定了骨相关MSCs(Bone-associated MSCs,BA-MSCs),研究了BA-MSCs中NLRP3和Caspase-11炎症小体的存在与功能,并借助NLRP3、Caspase-11、Caspase-1/11三种基因敲除小鼠进行了验证;然后构建了细菌感染性炎症和炎症性肠病小鼠模型,在体内进一步确认了BA-MSCs中存在炎症小体;最后为了抑制BA-MSCs的促炎作用,本研究还进行了炎症小体抑制剂的研究。主要研究结果如下:1.体外研究证实了BA-MSCs中存在NLRP3炎症小体本研究首先采用LPS/Nigercin刺激野生型小鼠来源的BA-MSCs,通过扫描电镜和免疫荧光等技术,发现LPS/Nigercin刺激引起BA-MSCs细胞表面小孔增多和焦亡执行分子GSDMDC1蛋白水平增加,表明炎性刺激可引起BA-MSCs发生焦亡。免疫印迹和实时定量PCR确认了炎性刺激可引起MSCs中NLRP3炎症小体相关蛋白上调和Caspase-1被切割。ELISA检测发现LPS/Nigercin刺激引起BA-MSCs分泌IL-1β和IL-18。借助于NLRP3基因敲除小鼠进一步确认BA-MSCs中存在NLRP3炎症小体,通过扫描电镜、免疫荧光、免疫印迹及ELISA等方法,发现NLRP3基因敲除只抑制了BA-MSCs分泌IL-1β,不能抑制焦亡。2.体外研究证实了BA-MSCs中存在Caspase-11炎症小体考虑到Caspase-11炎症小体也可引起细胞焦亡,本研究通过实时定量PCR和免疫印迹,发现LPS/Nigercin刺激引起BA-MSCs中Caspase-11基因转录水平和蛋白水平均明显提高,提示BA-MSCs中Caspase-11炎症小体被激活。利用Caspase-11基因敲除小鼠,研究BA-MSCs中Caspase-11炎症小体的存在与功能。通过扫描电镜的观察和免疫荧光实验,发现Caspase-11基因敲除抑制了BA-MSCs上的小孔数量的增加和GSDMDC1蛋白的形成,表明Caspase-11炎症小体在BA-MSCs焦亡过程中发挥重要作用。为了更清楚确认BA-MSCs中NLRP3炎症小体和Caspase-11炎症小体的功能,利用Caspase-1/11双基因敲除小鼠研究BA-MSCs的焦亡及其分泌IL-1β/IL-18的情况,发现Caspase-1/11双基因敲除小鼠中的BA-MSCs焦亡受到抑制,其分泌IL-1β/IL-18的水平下降,确证了BA-MSCs存在Caspase-11炎症小体。3.体内研究证实了MSCs中存在NLRP3和Caspase-11炎症小体体外实验初步证明了BA-MSCs中存在NLRP3炎症小体和Caspase-11炎症小体之后,本研究进一步探索了炎症小鼠模型体内BA-MSCs的炎症小体。先采用大肠杆菌和铜绿假单胞菌建立了小鼠感染性炎症模型,通过免疫印迹和免疫荧光分析,发现感染小鼠体内BA-MSCs中NLRP3炎症小体相关蛋白、Caspase-11以及GSDMDC1水平上调,Caspase-1和Caspase-11被切割,并出现细胞焦亡,表明细菌感染可引起体内BA-MSCs中NLRP3和Caspase-11炎症小体活化。为探讨BA-MSCs中炎症小体激活的普遍性,建立了硫酸葡聚糖(DSS)诱导性IBD模型小鼠。发现IBD小鼠模型中BA-MSCs胞内NLRP3炎症小体被活化,但Caspase-11炎症小体未被激活。4.证实了新型小分子化合物可抑制BA-MSCs中炎症小体为了调控BA-MSCs中炎症小体的活性,本研究还进行了新型小分子抑制剂66PR抑制BA-MSCs中炎症小体活性的研究。免疫印迹发现经66PR处理的BA-MSCs在炎性刺激时,NLRP3炎症小体相关蛋白表达下调,Caspase-1的切割体减少,同时Caspase-11的切割体也明显减少。ELISA检测发现经66PR处理的BA-MSCs分泌IL-1β水平下降,扫描电镜和免疫荧光分析发现经66PR处理的BA-MSCs焦亡减少。这些结果表明66PR可在体外抑制BA-MSCs中炎症小体的激活。为了探索体内66PR对BA-MSCs的作用,将66PR直接注射到IBD小鼠腹腔内,免疫印迹检测发现BA-MSCs中Caspase-1的切割减少,焦亡也减少,说明66PR在体内也可抑制BA-MSCs中炎症小体的激活。将经66PR处理的BA-MSCs移植输注给IBD小鼠,可缓解炎性肠病症状,BA-MSCs存活率升高,表明66PR预处理BA-MSCs可提高其治疗炎症性肠病的效果。【结论】本研究通过细胞及小鼠炎症模型,体内、体外证实BA-MSCs中存在NLRP3和Caspase-11两种炎症小体。在BA-MSCs中,NLRP3炎症小体主要调控促炎因子IL-1β和IL-18的分泌,而Caspase-11炎症小体的主要功能是诱导焦亡。本研究还发现一种新型小分子化合物66PR,可以抑制BA-MSCs中炎症小体。使用66PR预处理BA-MSCs可以提高其在炎症性肠病中的治疗效果。本研究加深和拓展了对MSCs功能的认识,为解析MSCs免疫调控作用的机制和优化MSCs治疗炎症性疾病的策略提供了新的理论和实验依据。