油菜是主要的油料作物之一,也是较理想的冬季作物,在中国已经形成油菜和水稻轮作的栽培模式,但现在推广的甘蓝型油菜品种生育期较长,影响了后茬水稻的栽培,而且高温或雨季等不良气候也较大影响了晚熟品种的产量和品质。因此,选育高产优质的早熟新品种就显得尤为重要,这也是当前我国油菜育种的主要目标之一。油菜开花时间是决定其成熟期早晚的一个重要指标,而开花作为植物从营养生长向生殖生长转换的关键环节,在植物的一生中起着非常重要的作用,因而对其机理进行研究是十分有意义的。虽然人们对植物成花机理的研究已有一百多年,但目前仍然没有形成一套系统的、适用于各种植物的理论,因而需要对更多植物包括油菜进行成花机理的系统研究。本文主要研究内容有:(1)以RG-8M(甘蓝型油菜晚熟品种RG-8的早熟突变体)、‘福油-4’(中晚熟品种)和RG-8为试验材料,研究不同熟性油菜成花过程中的生理生化变化;(2)以RG-8M为材料,通过cDNA末端快速克隆(RACE)技术,克隆油菜成花相关基因LEAFY(LFY)和CONSTANS(CO),并初步检测它们在不同发育时期和不同器官的表达情况;(3)以RG-8M、‘福油-4’和RG-8为材料,运用蛋白质组学技术,对三种春化和未春化油菜叶片的蛋白质进行了差异分析。主要的研究结果如下:1.成花期间三个油菜品种叶片中的淀粉含量总体呈快速下降的趋势,(α+β)-淀粉酶(主要是β-淀粉酶)活性及可溶性糖含量则呈上升的趋势,说明淀粉可通过淀粉酶等水解为可溶性糖类物质,使油菜中可利用的碳水化合物增多,从而有利于油菜成花。成花期间油菜叶片中的还原糖和果糖含量总体呈上升趋势,说明高水平的还原糖、果糖可能是作为结构物质或能源物质对油菜的成花起促进作用。在成花的多数时期,RG-8M可溶性糖、还原糖和果糖的含量明显低于‘福油-4’和RG-8,说明相对较低的这些糖含量有利于油菜提早成花。蔗糖含量及与之呈负相关的酸性转化酶活性在不同油菜品种的成花过程中表现不一,可能与蔗糖不仅仅是能量供应物而是一种信号物质有关,而成花期间RG-8M酸性转化酶的高活性表现可能是它更早成花所需要的。2.成花期间三个油菜品种叶片中的可溶性蛋白质和游离氨基酸含量在开始花芽分化之前水平较低,之后则呈不同程度上升的趋势,说明低水平的可溶性蛋白质、游离氨基酸有利于油菜花芽分化的启动,而高水平的可溶性蛋白质、游离氨基酸可为油菜花芽形态分化和发育提供物质保证,满足其营养要求,从而有利于油菜成花。三个油菜品种的对比说明,适量的高水平可溶性蛋白质、游离氨基酸含量有利于RG-8M提早成花。花芽形态分化期间油菜叶片中的核酸(主要是RNA)总量和DNA含量均同时增加,说明这个阶段有旺盛的DNA复制、RNA合成过程,可促进蛋白质的合成,从而有利于油菜花芽分化。与‘福油-4’和RG-8相比,RG-8M花芽分化期间更多的RNA含量与更高的RNA/DNA表明,它可能有一个更旺盛的核酸指导下的蛋白质合成过程,所合成的特殊蛋白质与酶类促使其更早花芽分化。成花期间不同油菜品种的RNase、DNase活性变化趋势各不相同,但都是在现蕾期之前保持低水平的状态,说明这个阶段核酸的分解代谢较弱,合成代谢占据着主导地位,这对油菜的花芽分化是有利的。3.成花期间三个油菜品种叶片中的GA3含量在花芽分化始期之前下降,之后上升的趋势表明,低含量的GA3有利于油菜花芽分化的起始,而高含量的GA3有利于油菜花芽形态分化及发育。对油菜成花过程中另外三种激素的研究表明,低含量的IAA和高含量的ABA、ZR有利于油菜的花芽分化。成花期间RG-8M每种激素含量总体低于‘福油-4’和RG-8的现象说明,相对较低的激素水平有利于油菜提早成花。另外,高比值的ABA/GA3、ZR/GA3可促进油菜的花芽分化,特别有利于花芽分化的起始,而较高的ABA/IAA比值与较低的ZR/ABA比值有利于油菜整个的成花过程。成花期间与IAA含量呈负相关的IAAO活性总体呈上升的趋势,与IAA含量变化趋势相反,说明较高的IAAO活性有利于油菜的花芽分化,IAAO是油菜成花过程中分解IAA的主要酶类。而与IAA含量相关程度不高的POD在花芽分化始期之前呈上升趋势,说明POD活性的升高有利于油菜花芽分化的起始,其对花芽分化的影响并不完全靠氧化IAA来实现,而成花期间RG-8M POD相对的高活性表现可能是它更早成花所需要的。4.成花期间三个油菜品种叶片中的PAs(主要是Put和Spd)含量在花芽分化始期之前呈下降的趋势,之后开始上升,而且不同品种上升的趋势及到达峰值的时间有较大差异,RG-8M的上升幅度大于‘福油-4’和RG-8,到达峰值的时间也更早。可见,较低含量的PAs有利于油菜花芽分化的起始,含量的增加有利于花芽形态分化及发育,越早熟的品种其体内PAs含量越早到达较高水平。PAO活性的变化趋势与PAs总量的变化较一致,它们之间呈极显著正相关,说明高的PAO活性也是有利于成花的。成花期间三个油菜叶片中的绿原酸含量变化总体呈下降的趋势,说明较低的绿原酸水平是有利于油菜成花的,而且在花芽分化过程中越早熟的油菜品种所需的绿原酸相对含量越高。5.根据已知的LFY同源基因保守区序列设计简并引物,以RG-8M基因组DNA为模板,克隆到了油菜的LFY同源基因片段,再根据获得的同源基因片段设计特异性引物,采用RACE技术获得了油菜中LFY同源基因BnLFY的全长cDNA序列。该基因cDNA全长为1310bp,包含一个长为1248bp的开放阅读框(ORF),编码415个氨基酸,其推测的氨基酸序列具有其他双子叶植物LFY类蛋白特有的区域,即N端的脯氨酸富集区、中央的酸性区、亮氨酸拉链结构以及富含赖氨酸与精氨酸的碱性区,这是一些转录因子的结构特征。该氨基酸序列与几种十字花科植物LFY类蛋白的氨基酸序列同源性高达85%以上。RT-PCR技术对该基因的转录表达情况研究表明,BnLFY基因在油菜中为组成型表达,其表达无发育时期和组织特异性。6.采用克隆BnLFY基因的方法,获得了油菜中CO同源基因BnCO的全长cDNA序列。该基因cDNA全长为1348bp,包含一个长为1281bp的ORF,编码426个氨基酸,其推测的氨基酸序列具有完整的植物CO类蛋白的结构,含有高度保守的B-box型锌指结构域和CCT结构域,说明它编码的是一个完整的转录因子,由于含有两个完整的B-box结构,故属于CO基因家族的第一类。BnCO基因编码的氨基酸序列与与油菜、芥蓝、黑芥和白芥的同源性较高,尤其是3’端和5’端,与油菜BnCoa1、Bn9CON10和Bn1CON19蛋白的同源性几乎为100%,因此推测这些区域是该基因功能作用的必需区域。尽管BnCO基因与前人克隆出的油菜CO同源基因同源性较高,但该基因编码的蛋白在中间部位多出一段含60个氨基酸的序列,推测BnCO基因是油菜CO基因家族里的不同于它们的另一个成员。RT-PCR技术对该基因的转录表达情况研究表明,BnCO基因在油菜中为组成型表达,其表达无发育时期和组织特异性。7.通过比较分析三种春化油菜和未春化油菜叶片的蛋白质图谱,共找出27个差异蛋白质,其中6个是三个品种所共有的。对这些差异蛋白质进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)及数据库检索分析,共成功鉴定了其中的22个蛋白质。鉴定的蛋白质根据功能的不同可以分为光合作用相关蛋白(45%)、能量代谢相关蛋白(14%)、抗氧化作用相关蛋白(9%)、蛋白质和氨基酸代谢相关蛋白(14%)、逆境抗性相关蛋白(14%)和转运相关蛋白(5%)6个主要类群。其中核酮糖-1,5 -二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)、Rubisco大亚基、推定的光系统Ⅰ第三类叶绿素a/b结合蛋白以及磷酸丙糖异构酶不但与油菜的春化作用密切相关,而且与油菜的熟性也有关系,即越晚熟的油菜品种,这几种蛋白质的表达差异越大。碳酸酐酶、23 kD亚基、推定的ATP合成酶δ亚基,AT2G37660、胰蛋白酶抑制剂前肽、60S酸性核糖体蛋白P3、核糖体蛋白L12-A、O-乙酰丝氨酸硫解酶在RG-8M中的表达差异与‘福油-4’、RG-8完全不同,推测这些蛋白质可能与油菜的早熟相关。