论文部分内容阅读
目的：从信号通路调节和神经递质释放角度探讨肉苁蓉中有效成分对急性衰老保护作用的体外研究。 方法：（1）MTT法检测细胞存活率，确定D-半乳糖诱导PC12神经细胞损伤模型的剂量和作用时间，毛蕊花糖苷、crenatoside和肉苁蓉多糖分别干预以后，Western Blotting从蛋白水平检测CREB、p-CREB蛋白的表达水平。ELISA法检测环腺苷酸(cAMP)、cAMP依赖蛋白激酶（PKA）和脑源性神经营养因子(BDNF)的含量。试剂盒检测SOD、MDA和LDH的含量。（2）UPLC/Q Exactive MS法建立PC12细胞分泌的谷氨酸、多巴胺和去甲肾上腺素的含量测定方法；流动相为乙腈-水(0.1％甲酸，10mmol/L醋酸铵)=4：96；流速为0.2mL·min-1；柱温为30℃；进样量为5uL。电喷雾离子化源(ESI)，扫描模式为Full MS/SIM，采集质量范围为140-200Da，正离子检测模式；一级质谱分辨率为70000FWHM。选择离子检测(SIM)：m/z154.08(DA)，m/z170.08(NE)，m/z148.05(Glu)。外标法定量。在此条件下进行专属性考察、线性范围考察、精密度实验、回收率实验等一系列方法学实验。 结果：（1）16g/LD-gal暴露PC12细胞40h后，MTT检测细胞存活率达(46.67±6.59)%，与对照组比较差异具有显著性意义(P＜0.05)，表明成功建立了细胞衰老模型。（2）与模型组比较，各给药组作用24h后，p-CREB表达增加(P＜0.05)，PKA、cAMP、BDNF和SOD水平提高(P＜0.05)，MDA和LDH水平下降(P＜0.05)，并且有剂量依赖性。阻断剂H-89干预后1h后，p-CREB表达减少，PKA、cAMP、BDNF和SOD水平显著降低(P＜0.05)，MDA和LDH水平升高(P＜0.05)。（3)建立了PC12细胞分泌DA、NE、Glu同时测定的UPLC/Q Exactive MS法。DA和Glu在3-2000ng/mL浓度范围内线性关系良好，最低定量限为3ng/mL；NE在100-2000ng/mL浓度范围内线性关系良好，最低定量限为100ng/mL；三种神经递质的加标回收率高，精密度RSD均小于5%；常温放置8h稳定性，4℃冷藏7天后稳定性以及-20℃冷冻一个月后稳定性良好。 结论：（1）肉苁蓉中毛蕊花糖苷、crenotaside和肉苁蓉多糖对衰老的神经细胞有明显的保护作用，其机制与上调cAMP/PKA/CREB信号通路有关。（2）本实验建立的同时检测PC12细胞分泌DA、NE和Glu的UPLC/Q Exactive MS方法，灵敏度高、稳定性好、测得数据可靠。