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目的: DNA异常甲基化在肿瘤的发生发展中具有重要的作用。本文旨在探索甲胎蛋白(AFP)基因启动子区域甲基化状态与其表达水平之间的关系。方法:1.细胞培养:选取人源MHCC97_H肝癌细胞株,传代培养,用于提取细胞总蛋白、RNA和DNA。2.原位移植裸鼠模型:购买人源MHCC97_H肝癌细胞株原位移植术后的人源肝癌裸鼠模型10只饲养.六周后断颈处死,取肝癌组织,提取组织蛋白、RNA及DNA。3.模型鉴定:分别提取细胞株及组织的基因组DNA,-20℃保存备用。以动物肝癌组织基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子区域,将扩增产物进行测序,并与人AFP基因启动子序列对比,以确定模型的成功建立。4.Western Blot:将提取的MHCC97_H肝癌细胞总蛋白、人成纤维细胞总蛋白及动物肝癌组织蛋白进行SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,免疫结合及显影,测定细胞及肝组织中AFP蛋白的表达。以β-actin为内参照,对比AFP表达水平。5.在线软件(http://www.humgen.nl/primer_design.html)设计AFP基因启动子区MSP/BSP引物;普通引物由Primer Premier 5.0软件设计。6.RT-PCR:TRIzol提取细胞及组织RNA,逆转录为cDNA;以cDNA为模板PCR合成AFP基因片断.以β-actin为内参照,凝胶图像分析软件分析,对比AFP表达水平.7.亚硫酸氢盐(HSO3-)修饰:将基因组DNA亚硫酸氢盐修饰后, Wizard DNA Purification System纯化除去未反应的HSO3ˉ,沉淀过夜获得MoDNA(Modificative DNA),-20℃保存备用.8.甲基化特异性PCR(MSP):以MSP引物扩增MoDNA模板,电泳对比PCR产物,检测AFP基因启动子区在肝癌细胞株、其他癌细胞株、癌组织及癌旁组织中的甲基化密度。9亚硫酸盐测序(BSP):以BSP引物扩增MoDNA模板,电泳核对产物长度后,回收PCR产物,自动测序仪测序,确定AFP基因启动子区在不同细胞和组织中的甲基化修饰位点。结果:1细胞形态学观察:MHCC97_H细胞呈多角形,大小异型性明显,排列紊乱;核浆比例倒置,核内不均匀,核仁清晰、多个;细胞生长失去正常的接触抑制,铺满瓶底后有重叠现象。2原位移植裸鼠模型:先取5×106～5×107个对数生长期细胞接种于一只Blab/c品系裸鼠右侧颈背部,约一周后成黄豆大的瘤块。处死种鼠,完整取下瘤块,切割成小的移植用瘤块一如鼠肝叶内。肝内移植时,无菌条件下将裸鼠用巴比妥钠腹腔麻醉。术后四周触摸裸鼠腹部,10只裸鼠均能触到黄豆粒大小的硬块,模型鼠皮肤粗糙泛白,无光泽.不喜活运动动,更爱卧睡,萎靡不振,周身消瘦。肉眼观:腹部区可见大片白色区域,触之有硬物存在,且随着时间的推移逐渐增大,甚至突出,于皮肤外形成一个鼓包隆起。最大者可达蚕豆般大小。3模型鉴定:取模型肝癌组织DNA序列同NCBI中人AFP基因的启动子序列具有高度同源性。4 Western Blot:分别取MHCC97_H细胞珠、人成纤维细胞珠及动物模型肝癌组织的总蛋白做Western Blot可看出:MHCC97_H细胞珠和动物模型肝癌组织的蛋白中含有甲胎蛋白(AFP),而人成纤维细胞株蛋白中不含该目的蛋白。5 RT-PCR:选取OD260/280>1.8的RNA产物,以预先合成好的AFP特异性序列引物合成PCR产物。电泳可见,MHCC97-H细胞珠和动物模型肝癌组织的RNA均可扩增出预定长度为350bp和451bp的条带,前者为根据β-actin DNA序列设计引物合成的PCR产物的条带,后者为根据AFP DNA序列设计引物合成的PCR产物的条带。其长度分别与设计长度相吻合。而人成纤维细胞珠的RNA只能扩增出长度为350bp的条带,表明实验结果可信且特异。6 MSP检测结果:电泳结果可见,MHCC97_H细胞株和动物模型肝癌组织的DNA修饰后经甲基化引物可扩增出142bp的模糊条带,经非甲基化引物扩增出150bp的清晰条带,而在成纤维细胞中出现相反的现象。表明二者启动子区DNA序列的非甲基化水平较高,而甲基化水平较低。7 BSP检测结果:电泳结果显示,以成纤维细胞、MHCC97_H细胞及鼠肝癌组织的MoDNA位模板进行PCR,均可扩增出目的条带,长度为248bp,符合预期长度。测序结果经DNAssist 1.0对比分析可见MHCC97_H细胞及动物肝癌组织的DNA启动子区甲基化程度低于正常对照,其中两个cg位点可以作为肝癌检测位点。结论:1 AFP基因在肝癌细胞及人源裸鼠模型的肝癌组织中表达,正常细胞不表达。2 AFP基因启动子区甲基化程度负影响AFP基因表达水平。3 BSP法精确测定动物肝癌组织DNA启动子区甲基化程度低于正常对照,其中两个cg位点可以作为肝癌检测位点,分别位于AFP全基因组序列-2494bp,-2431bp处。