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内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)是存在于外周血、骨髓及组织中,具备定向分化为成熟血管内皮潜能的前体细胞,是一类干细胞群体的总称。在创伤、炎症及失血所导致的组织损伤过程中,骨髓中的EPC可被大量动员,释放入外周血,在VEGF、SDF-1等趋化因子的作用下富集于损伤部位,修复血管内皮,改善局部血供,对组织的修复有着重要的意义。近年来,体外培养EPC用于治疗缺血性疾病及炎症损伤已得到广泛的研究。多器官功能障碍综合征(MODS)是指机体遭受严重创伤、休克或感染24h后同时或序贯出现2个或2个以上的系统或器官的功能障碍,是多种疾病最严重的并发症和最终结局。创伤及感染是发生MODS的两个重要诱因,两者均可激活炎症细胞及因子,使机体产生过度的应激及炎症反应,内皮细胞是炎症介质首先打击的靶细胞,其损伤和功能紊乱,导致炎症反应的放大,内环境无法保持稳态,导致MODS的发生。本实验通过以慢病毒载体介导hVEGF165-GFP基因转染EPC,并观察其对双相迟发MODS动物模型脏器功能、微循环改变的影响,研究异体移植EPC对MODS的治疗作用及相关机制,并探寻其更优方案。本实验共分为三个部分：一、体外分离、培养及鉴定兔骨髓来源的EPC,检测其增殖、分化及成血管能力,为异体移植提供可靠的技术平台和细胞来源：二、构建慢病毒载体,将VEGF-GFP目的基因转染入EPC,监测细胞增殖功能变化；三、异体移植EPC用于治疗MODS动物,观察移植后重要脏器功能改变、微循环中血栓形成情况以及内皮祖细胞相关细胞因子(MCP-1,ANG-1)的表达情况,评价转染VEGF-GFP双表达基因的EPC对MODS的治疗效果。第一部分家兔骨髓来源内皮祖细胞的培养及鉴定本部分旨在建立起家兔骨髓来源的EPC的标准化分离、培养、扩增及鉴定的方法,为下一步病毒转染及EPC移植治疗MODS的研究提供技术平台及细胞来源。密度梯度离心法分离家兔骨髓,提取、纯化单个核细胞,按照1×105/cm2的密度接种于培养皿内,以含有多种促生长因子(VEGF、bFGF)及胎牛血清的内皮祖细胞专用培养液培养及诱导分化,观察细胞形态、数量变化,并进行传代扩增。对培养的P3代EPC进行形态学特征、超微结构、表面抗原(CD133、CD31、KDR)及吞噬实验(FITC-UEA-1、Dil-ac-LDL)、体外血管生成功能等检测及鉴定,以确认培养的细胞即是EPC,为后文的移植治疗做好准备工作。结果显示：培养24-48小时后即出现梭形贴壁细胞,培养6-8天为细胞增殖高峰,可观察到集落形成。消化传代后,检测P3代细胞,电镜下可见内皮细胞特异性标志—Weibel-Palade小体；细胞表面抗原检测表明CD133阳性率为4%,,CD31及KDR阳性率超过90%；贴壁细胞可特异性摄取了Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1,表现出内皮细胞的特征。P3代细胞体外生成血管功能检测提示细胞间可相互连接,生成毛细血管网状结构。本部分实验从兔骨髓中分离出单个核细胞,并成功诱导分化出带有干细胞表型及血管内皮细胞特征,能有效形成毛细血管结构的EPC。第二部分慢病毒载体的构建和内皮祖细胞的转染本实验部分构建hVEGF/GFP双表达基因慢病毒载体,并转染体外培养的内皮祖细胞,为下一步的细胞移植治疗MODS提供相关的细胞来源。将预先构建的hVEGF165-GFP双表达盒连接至穿梭质粒pDC315的多克隆位点上。得到重组穿梭质粒pDC315-hVEGF165-GFP。利用酶切技术,将hVEGF165-GFP目的片段连接于慢病毒载体的转移质粒上,构建FUGW/hVEGF165-GFP转移质粒,将慢病毒转移质粒FUGW/hVEGF165-GFP,包装质粒pCMVR-delta8.9及包膜质粒VSVG通过磷酸钙法三质粒瞬时共转染293 FT细胞,得到LV/hVEGF165-GFP,将LV/hVEGF165-GFP与EPC共培养以感染EPC。检测转染后细胞增殖能力。结果表明,目的基因插入慢病毒过表达载体pWPXL-MOD后PCR扩增载体片段与目的片段均可表达；EPC经转染hVEGF-GFP双表达基因后均能稳定表达VEGF及GFP,且细胞增殖能力较未转染前显著提高。第三部分转染hVEGF165-GFP基因内皮祖细胞对兔MODS模型微血栓形成的影响本部分实验在构建MODS动物模型的基础上,予异体移植体外培养的EPC及转染hVEGF-GFP双表达基因的EPC,观察重要脏器的功能变化及微循环中血栓的形成情况,并检测EPC旁分泌功能相关细胞因子,以了解EPC移植对MODS的治疗作用及相关机制,并探索其更优方案。健康家兔36只,随机分为三组,予失血性休克及内毒素打击,构建MODS模型：未治疗动物12只作为对照组(M组)；12只动物行单纯EPC移植(ET组)；12只动物予转染hVEGF-GFP双表达基因内皮祖细胞。移植时间点为内毒素打击后1小时,移植数量为1×107/公斤体重,监测脏器功能变化,动物死亡或观察96h后处死,取脏器行病理学检查,Masson及HE染色后对组织中微血栓进行计数,并采用ELISA法检测组织中MCP-1及ANG-1水平差异。实验结果提示：移植EPC均能有效改善动物各重要脏器功能,减少微循环中血栓形成,并通过旁分泌机制,促进组织修复,降低MODS发生率及动物死亡率,对MODS有积极的治疗效果。