研究背景：人脑胶质瘤是中枢系统最常见的原发性肿瘤,其中胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)约占50%。胶质母细胞瘤是由星形胶质细胞瘤恶性变而来,是恶性程度最高的星形细胞瘤。患者发病年龄多在45-70岁之间,临床病史较短,预后差,平均生存时间约6个月,50%的胶质母细胞瘤病例病程不足3个月。目前对胶质瘤主要采用手术加放、化疗等综合性治疗,但均不能根治,严重影响着人类的健康。因此,迫切需要一种新的治疗方法来改善胶质母细胞瘤患者的预后及生活质量。目前,人们普遍认为胶质母细胞瘤的低分化、抗调亡和高侵袭性等特点是其预后不良的根本原因。在新兴的基因治疗的探索中,许多和脑胶质瘤的恶性特征密切相关的基因如VEGF等被筛选出来作为治疗的靶点,然而由于体内许多器官的正常细胞也表达该基因,使将其应用到临床诊断治疗造成了困难。因此如果能找到一个脑胶质母细胞瘤特异性靶基因,有望使胶质母细胞瘤的基因诊疗有所突破。人类Single-minded 2 (SIM2)基因是人SIM家族成员之一,定位于人类21号染色体的Down氏综合征(21三体)临界区域(Down Syndrome Critical Region, DSCR)。由于选择性剪切,SIM2基因产物至少以两种不同的亚型存在,SIM2-s和SIM2-1. SIM2-s和SIM2-1在肺、肾脏、骨骼肌、睾丸和扁桃体中均表达,在骨髓中有低水平的SIM2-1表达。在胚胎发育过程中,SIM2-s和SIM2-1在胎心和胎肾中均表达,并有研究显示,SIM2基因对大脑发育和神经元分化有重要作用。在对Down氏综合征患者的癌症发生率的相关研究中发现,其罹患白血病的危险性提高了20倍。在对21号染色体的进一步研究中发现,其中的SIM2基因可能参与了肿瘤的发生。有一系列的研究证实,SIM2基因在结肠癌、前列腺癌和胰腺癌肿瘤组织、转移灶和细胞系中均有高表达,而在相应的正常组织中则不表达,并且SIM2-s的表达在结肠癌和前列腺癌中有时期特异性的特点。在一个103例前列腺癌病人的单变量生存期分析中,肿瘤组织的阳性SIM2-s表达与减少的生存期密切相关。在术前血清PSA、组织学分级、病理分期和SIM2-s表达的单变量分析中,只有组织学分级和SIM2-s表达与生存期显著相关。有研究证实,人胶质母细胞瘤细胞系T98G强烈表达SIM2-s,提示SIM2-s可能与人脑胶质母细胞瘤恶性特征相关。我们查阅文献未见有SIM2-s与人脑胶质瘤相关性的研究报道。因此考虑可以以SIM2-s为研究对象,观察其在脑胶质母细胞瘤细胞系及临床标本中的表达情况,并通过一系列实验检测其在胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用,从而探讨其在脑胶质瘤治疗中的意义。目前基因阻断主要包括以下几种策略：显性负性调节,反义核苷酸,生化制剂,双链或单链诱骗寡核苷酸,RNA干扰技术等。RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式,是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNA干扰是通过小干扰RNA介导的特异性高效抑制基因表达途径,由小干扰RNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。由于使用RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。本课题旨在研究和探讨应用RNA干扰技术靶向性抑制SIM2-s基因的表达导致人脑胶质母细胞瘤细胞侵袭性的变化和机制。研究内容分为以下三个部分。一、人脑胶质母细胞瘤细胞及组织中SIM2-s的表达研究目的检测人脑胶质母细胞瘤细胞系以及临床标本中SIM2-s的表达情况,为针对SIM2-s治疗胶质母细胞瘤的实验研究奠定基础。方法1、RT-PCR和Western印迹方法检测人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251中SIM2-s的表达情况。2、RT-PCR、Western印迹方法和免疫组化法检测115例临床标本中SIM2-s的表达情况。其中63例胶质瘤,21例脑膜瘤,23例垂体腺瘤,8例正常脑组织。63例胶质瘤中胶质母细胞瘤为43例。并对其表达情况进行统计学分析。结果1、人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251中存在SIM2-s的表达。2、SIM2-s特异性表达于人脑胶质瘤标本特别是胶质母细胞瘤标本中,而其它常见脑肿瘤(如脑膜瘤和垂体腺瘤)及正常脑组织则不表达。其中,星形细胞瘤标本中SIM2-s的mRNA阳性率和蛋白阳性率分别为7.7%和15.4%,间变性星形细胞瘤标本为14.3%和14.3%,而胶质母细胞瘤标本为41.9%和60.5%。结论1、人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251中存在SIM2-s的表达,可以作为本课题的研究对象。2、人脑胶质瘤组织中存在SIM2-s的表达,并且随着胶质瘤恶性程度的增高,SIM2-s的表达阳性率也增高,而其它常见脑肿瘤和正常脑组织则不表达,提示SIM2-s的表达具有胶质瘤特异性,并且与胶质瘤的恶性程度相关。为通过抑制SIM2-s的表达来研究胶质母细胞瘤的基因治疗奠定了基础。二、小干扰RNA技术沉默SIM2-s的表达对胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭性的影响目的研究阳离子脂质体转染SIM2-s小干扰RNA的效果和效率,检测转染SIM2-s小干扰RNA对人脑胶质母细胞瘤细胞系中SIM2-s的沉默效果,检测SIM2-s小干扰RNA沉默SIM2-s后对人脑胶质母细胞瘤细胞增殖的影响,检测SIM2-s小干扰RNA沉默SIM2-s后对人脑胶质母细胞瘤细胞侵袭性的影响。方法1、应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导的转染法将荧光小干扰RNA转染导入人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251内,并在荧光显微镜下观察转染效果和效率。2、应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导的转染法将三条人工合成的SIM2-s小干扰RNA序列转染入人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251内,并于24小时后收集细胞进行总RNA提取及RT-PCR扩增,检测三条SIM2-s小干扰RNA序列的干扰效果。3、RT-PCR和Western印迹方法检测转染SIM2-s小干扰RNA之后人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251中SIM2-s的表达变化。4、细胞计数法和MTT方法检测转染SIM2-s小干扰RNA之后人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251增殖情况的变化。山东大学博士学位论文5、Transwell方法检测转染SIM2-s小干扰RNA之后人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251侵袭能力的变化。结果1、应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导的转染技术,能够将荧光siRNA高效转染入人脑胶质母细胞瘤细胞。2、三条SM2-s小干扰RNA序列均能够有效地沉默人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251中SIM2-s的表达,其中以序列3干扰效果最好,序列3 SIM2-s小干扰RNA能够降低目的基因60%-80%的mRNA转录水平和40%-50%的蛋白表达水平。3、转染SIM2-s小干扰RNA之后,没有发现人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251增殖能力的变化。4、转染SIM2-s小干扰RNA之后,人脑胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251侵袭能力明显下降。结论1、应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导的转染技术,能够将荧光siRNA高效转染入人脑胶质母细胞瘤细胞,因此亦能够将SIM2-s小干扰RNA高效转染入人脑胶质母细胞瘤细胞。2、序列3 SIM2-s小干扰RNA能够有效地沉默人脑胶质母细胞瘤细胞中SIM2-s的表达,后续实验将以序列3小干扰RNA为干扰试剂。3、沉默SIM2-s的表达之后,对于人脑胶质母细胞瘤细胞的增殖没有明显的影响。4、沉默SIM2-s的表达之后,对于人脑胶质母细胞瘤细胞的侵袭性有明显的抑制作用。三、小干扰RNA技术沉默SIM2-s的表达抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭性的机制研究目的检测在RNA干扰技术沉默掉SIM2-s后侵袭性相关基因如基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)和TIMP-2等的表达变化情况,探讨导致胶质母细胞瘤细胞侵袭性下降的相关机制。方法1、RT-PCR和Western印迹方法检测在转染SIM2-s小干扰RNA后侵袭性相关基因MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表达变化。2、明胶酶谱法检测在转染SIM2-s小干扰RNA后人脑胶质母细胞瘤细胞培养上清中MMP-2活性变化。结果1、在RNA干扰技术沉默SIM2-s后,人脑胶质母细胞瘤细胞侵袭性下降与基质金属蛋白酶相关。在转染SIM2-s小干扰RNA后,MMP-2 mRNA和蛋白水平均明显下降,而其抑制因子TIMP-2的mRNA和蛋白水平均明显上升,MMP-9的转录和翻译水平没有明显变化。2、在转染SIM2-s小干扰RNA之后,人脑胶质母细胞瘤细胞培养上清中分泌的MMP-2活性明显下降。结论1、SIM2-s小干扰RNA沉默目的基因之后,人脑胶质母细胞瘤细胞侵袭能力下降与MMP-2的表达降低和TIMP-2的表达升高具有相关性。2、SIM2-s小干扰RNA沉默掉目的基因之后,人脑胶质母细胞瘤细胞培养上清中MMP-2活性明显下降,进一步验证了胶质母细胞瘤细胞侵袭性的下降与基质金属蛋白酶家族有相关性。总之,通过本研究表明,SIM2-s特异性表达于人脑胶质瘤特别是胶质母细胞瘤中,并且SIM2-s表达阳性率与胶质瘤临床WHO分级相关。小干扰RNA技术沉默SIM2-s的表达后,胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力明显下降,进一步的研究发现这种侵袭性的降低与基质金属蛋白酶家族中MMP-2的升高和TIMP-2的降低相关。以上结果有利于进一步的动物体内实验研究,力图为胶质母细胞瘤的基因治疗提供新的策略。