在过去十几年里,DNA因其具有严格的碱基配对原则而成为一种有趣的组装元素用于可控的、程序化的设计和组装DNA纳米材料。粘性末端介导的链置换反应(Toehold-mediated strand displacement reaction, TSDR)是组装动态DNA纳米器件的基础反应。有效调控该反应的动力学速率对动态DNA纳米器件的可控组装和生物医学应用有重要的意义。Toehold区域碱基个数和序列组成的改变是目前主要的调控方式,但存在的问题是单个碱基的改变使其速率能够改变106级别,且碱基个数为6-10时反应速率即能达到饱和。因此,设计能够精确调控TSDR的Toehold活化方式是目前动态DNA纳米技术领域的一个难点。随着对TSDR研究的不断深入,它不但可作为DNA纳米材料的组装基元,还可直接作为生物分子识别元件。利用Toehold区域碱基的变化可大大改变反应速率的性质可对基因片段中单碱基突变进行有效区分。另外,将适体或核苷酸的互补序列设计在Toehold区域,通过引入特异信号转导机制,也可实现对蛋白质、小分子、microRNA等的识别和检测。但是对于核酸酶这类缺少特异性识别配体的生物分子,亟需开发一种有效的信号转导机制对其进行特异性和灵敏检测。酶促链置换扩增反应具有高敏感度、高特异性以及操作简便等特性,是目前核酸扩增技术中常用的技术手段,目前已被广泛应用于核酸、蛋白质、小分子等各种生物分子的分析检测以及生物医学研究中。基于以上论述,本论文基于TSDR的传统调节方式结合酶促链置换扩增构建了高灵敏和高特异性的单碱基突变检测方法。此外,还开发了环境刺激物响应的“缝合”Toehold活化策略,可用于TSDR的粗略调节和精确调节。在此基础上,将刺激物响应的发夹重构策略与酶促链置换扩增结合应用于尿嘧啶DNA糖基化酶的灵敏检测中。最后开发了核酸酶(以DNA修饰酶为模型)的信号转导机制,成功地构建了核酸酶响应的通用性DNA纳米器件。本论文主要分为五章：第一章为绪论部分,主要介绍了DNA的物理和化学性质以及作为DNA纳米材料组装基元的优势。对粘性末端介导的链置换反应的原理、调控方式、发展历程以及实际应用做了概述,总结了目前DNA纳米技术发展领域的难点和发展前景。此外,概述了酶促链置换扩增技术的发展以及应用。第二章,以Kras基因片段为模型,结合粘性末端介导的链置换反应和聚合、切刻酶辅助的等温放大反应,构建了一种高特异性、高灵敏的免标记荧光方法。该方法主要依赖识别发夹探针的Toehold区域末端为与目标基因错配的碱基。通过一个碱基的错配调节一个时间段内目标基因和错配基因的反应速率,差值最大时区分度最大。通过引入粘性末端介导的链置换反应,实现了突变位点不同类型错配的有效区分。聚合、切刻酶辅助的等温放大反应的高扩增效率使本方法的检测下限达到1.8 pM。第三章,以Hg2+和ATP为环境刺激物模型,引入发夹重构的机制,设计了一种刺激物响应的“缝合”Toehold活化策略。通过将环境刺激物的识别区域独立于Toehold和链迁移区域,可以实现通用性的DNA纳米器件的构建。此外,在本设计中既可以通过改变Toehold区域的序列组成和碱基个数实现对其反应速率进行粗略调控,也可通过改变发夹的结构以及刺激物的浓度对其进行精确调控。第四章,基于以上设计中提到的发夹重构机制以及酶促链置换扩增技术,我们设计了一个结构可变的双功能探针,该探针可将尿嘧啶DNA糖基化酶对底物的响应转化为酶促链置换扩增的开关。因此,一个探针的设计即可实现分子识别和信号输出双重功能,大大简化了探针的设计,为复杂体系中DNA修饰酶活性检测提供了保证。第五章,构建了一种DNA修饰酶响应的Toehold活化方式,结合通用的发夹探针,以即插即用的方式实现模块化分子器件的构建。以DNA尿嘧啶糖基化酶UDG和DNA甲基化酶M.SssI为模型,引入发夹重构机制和酶切保护机制,将目标物的检测转化为发夹自组装的引发链。两种酶作用后,产生的引发链中Toehold区域和链迁移区域的序列是一致的,因此,我们称其为引发模块。组装模块中采用的是序列完全一致的发夹探针。当引发模块插入到组装模块中后,发夹的动态自组装过程便可启动。