烟草（Nicotiana tabacum Lin.）（2n=4x=48）为茄科烟草属植物,是世界及我国的重要经济作物之一,一直受黑胫病等病症危害,常造成巨大损失。蓝茉莉叶烟草（N.plumbaginifolia）（2n=2x=20）对烟草黑胫病的抗性较强,且与普通烟草杂交亲和,是烟草抗黑胫病育种的优良抗源。远缘杂交可从作物的近缘材料中导入优良性状,是现代作物育种的常用方法。杂交及回交过程中,引入目标基因的同时,大量非目标基因也被引入,可能对作物的优良性状产生负面影响。筛选含目标基因而含较少非目标基因的材料是远缘杂交育种的主要内容。分子标记可快速、精确、大规模地对材料进行早期鉴定,在作物育种中已有广泛应用。分子标记辅助可在远缘杂交中较为准确地筛选目标材料。经多年研究,附加蓝茉莉叶烟草9号染色体的烤烟抗黑胫病异源单体附加系TP-1已被成功创制,后续将利用该株系培育抗黑胫病的优质烤烟新株系,进而培育优抗新品种。为加快优抗株系的筛选进度并提高筛选精确度,获得烟草基因组背景下蓝茉莉叶烟草9号染色体特有的分子标记非常有必要。但蓝茉莉叶烟草相关的研究较少,可供利用的标记也极少。为加快利用蓝茉莉叶烟草进行烤烟黑胫病育种的进度,精确筛选优抗新株系,本研究特利用转录组测序,通过表达量分析筛选特异表达序列,利用特异表达序列设计引物,对设计的引物进行扩增验证,以获得烟草基因组背景下蓝茉莉叶烟草9号染色体的特异标记。主要内容如下:1、转录组分析选取蓝茉莉叶烟草（染色体供体）、TP-1（异源单体附加系,云烟87基因组附加蓝茉莉叶烟草9号染色体）和云烟87（染色体受体）幼嫩叶片,每个材料3个重复,按常规方法提取总RNA,反转录后经Illumina Hiseq高通量测序平台测序获得转录组数据。9个样品共获得73.73Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到7.89Gb。通过无参考基因组进行序列拼装,组装共得到100121条unigene。统计不同序列的Cout数,并计算FPKM（Fragments per kilobase per million）值。2、特异表达序列挑选及引物设计选取在云烟87（未附加外源染色体的寄主材料）的3个重复中表达量（FPKM值）均为0,在蓝茉莉叶烟草（染色体来源物种）和TP-1（异源单体附加系）的3个重复中表达量（FPKM值）至少2个重复的表达量不为0的序列为特异表达序列。共获得942个特异表达序列。利用Primer5.0软件对选出的特异表达序列进行引物设计,其中718个特异表达序列能获得较为适宜的引物,选择分数在90分以上的引物,部分特异表达序列获得2对及以上的引物,最终得到了740对引物。3、引物的验证以蓝茉莉叶烟草、TP-1和云烟87的基因组DNA为模板,对设计的引物选择适宜的扩增体系进行PCR扩增,聚丙烯凝胶电泳对产物进行检测。结果显示:51对引物未能在3个材料中扩增出产物;3个材料中均能扩增出产物但无差异位点的引物472对;能在TP-1中扩增出蓝茉莉叶烟草特异位点的引物166对,为特异引物,占引物总数的22.43%。其中基因编号为c57171.graph＿c0的特异序列有2对特异引物、基因编号为c63766.graph＿c0的特异序列有3对特异引物;引物所在的表达序列为9号染色体的特异表达序列,为163条;引物所在基因组DNA序列即为9号染色体特异的基因组DNA序列。4、产物回收验证为对筛选的标记进一步验证,在166对特异引物中随机选取10对引物,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测,回收特异条带中的产物并进行测序,将自蓝茉莉叶烟草和TP-1基因组DNA中扩增的特异产物的序列进行比对。结果显示,同一对引物在蓝茉莉叶烟草和TP-1中扩增的序列相似度均超过95%。这证实,前面经验证的标记确为蓝茉莉叶烟草9号染色体的特有标记。5、特异序列注释和表达量为初步了解特异表达序列的功能,特利用多个数据库对其进行了注释,仅27.71%的序列有注释信息。表达量分析结果显示,163条特异序列中,大部分序列（143个）的表达量在蓝茉莉叶中的表达量（FPKM值）低于10,低于1的有55个;在TP-1中表达量低于10的特异序列有161个,低于1的有109个。经对比发现,特异序列在TP-1中的表达量总体较在蓝茉莉叶烟草中低;经过染色体数量对蓝茉莉叶烟草中的表达量进行加权计算后再对比,特异序列在TP-1中的表达量仍比在蓝茉莉叶烟草中低。可见,特异标记所在的表达序列多为功能未知序列,特异序列的表达均处于较低水平,且在新的基因组背景下,蓝茉莉叶9号染色体上的特异基因的表达可能受到抑制。综上所述,利用特异表达序列开发烟草基因组背景下蓝茉莉叶烟草9号染色体的特异分子标记的方法是可行的,本研究获得了166个特异标记,为利用抗黑胫病的异源单体附加系TP-1培育优质抗黑胫病烤烟新株系提供了重要参考。