论文部分内容阅读
目的药物性肝损伤(Drug-induced liver injury,DILI)临床表现多样,造成早期识别和诊断具有一定的困难,已成为全球关注的问题。官方机构数据显示DILI已成为全世界第五大死亡原因。DILI对人类健康构成了极大的威胁,对其进行研究具有非常重要的意义。对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)引起的肝损伤占DILI病例数50%以上,其诱导肝损伤的机制研究是一个热点。APAP引起肝损伤早期给予特效解毒剂N-乙酰半胱氨酸能阻止肝功能进一步恶化;然而,很大一部分患者至医院就诊时已处于肝损伤的中晚期,最终发展为肝衰竭甚至死亡。肝再生对于DILI后肝衰竭患者的生存至关重要。因此对肝再生的生理病理机制进行了解,开发研究控制这一过程的方法将其运用于临床,将为DILI病人的治疗开辟新方向,且病死率亦会显著降低。课题组前期实验发现TLR4参与APAP诱导的急性肝损伤中肝脏程序性坏死,而TLR4及其下游信号分子是否参与APAP诱导急性肝损伤后肝脏再生尚不清楚。因此本研究通过体外实验探讨TLR4下游信号分子STAT3在APAP诱导小鼠肝细胞损伤后肝细胞增殖中的作用?方法体外培养小鼠正常肝细胞AML12至对数生长期,加入胰酶消化,重悬细胞,控制细胞密度为1×105/ml。1.CCK8法检测.APAP对AML12细胞活力的影响:按每孔100μl将以上细胞悬液加至96孔板中。培养24 h后细胞贴壁完全,弃去细胞上层培养液。实验孔分别加入100μl预先配制好含不同浓度(1、2.5、5、10、20 mmol/L)APAP的细胞培养液,对照孔加入等体积AML12细胞培养液。培养箱孵育12 h、24 h、48 h,再加入CCK8试剂10μl,继续培养90 min后放至酶标仪上,在450 nm波长下测定各孔吸光度值。2.RT-PCR实验检测APAP对AML12细胞中增殖相关基因表达的影响:吸取细胞悬液加入T25培养瓶中,设置对照组、APAP(2.5mmol/l)组,分别作用24 h和48 h,采用RT-PCR法检测AML12中PCNA?Cyclin D1?Ki67的m RNA表达情况?3.CCK8实验检测酪氨酸激酶抑制剂AG490对AML12细胞活力的影响:取细胞悬液加入96孔板中,分别加入0(对照组)和10、50、100μmol/l AG490,作用2 h后加入2.5 mmol/l APAP继续作用48 h,加入CCK8试剂检测AG490对AML12细胞及APAP损伤后的AML12细胞活力的影响。(具体步骤同方法1)4.WB实验检测酪氨酸激酶抑制剂AG490对AML12细胞中STAT3?p-STAT3及增殖相关蛋白表达的影响:取上述细胞悬液加入10 cm2培养皿中,设置对照组,APAP组,AG490组,APAP+AG490组,APAP作用48 h,检测STAT3?p-STAT3以及PCNA?Cyclin D1表达水平?5.RT-PCR实验检测酪氨酸激酶抑制剂AG490对AML12细胞中增殖相关基因表达的影响:取上述细胞悬液加入T25培养瓶中,设置对照组,APAP组,APAP+AG490组,APAP作用48 h,检测AML12中PCNA?Cyclin D1?Ki67的m RNA表达情况?结果1.通过CCK8实验发现,APAP作用12 h,与对照组比较,APAP浓度组(1?2.5?5?10?20 mmol/L)AML12细胞活力均无明显变化(P>0.05);APAP作用24 h及48 h,与对照组比较,各浓度组AML12细胞活力均降低(P<0.05);当APAP在2.5 mmol/L的处理浓度下,24 h及48 h的AML12细胞活力分别为0.717±0.027、0.752±0.014,推测AML12细胞在2.5 mmol/l APAP浓度处理48 h时可能出现损伤后再生现象,因此选择2.5 mmol/L作为APAP的处理浓度?2.通过RT-PCR实验发现,与对照组比较,24 h APAP(2.5 mmol/l)组PCNA、Cyclin D1及Ki67 m RNA的表达均降低(P<0.01),48 h APAP(2.5 mmol/l)组PCNA、Cyclin D1 m RNA的表达水平均无明显变化(P>0.05),48 h APAP(2.5 mmol/l)组Ki67的m RNA的表达升高(P<0.01);与24 h APAP组比较,48 h APAP(2.5 mmol)组PCNA?Cyclin D1及Ki67 m RNA的表达均升高(P<0.01),因此选择APAP 2.5mmol/l、刺激时间48 h来模拟体外损伤AML12细胞后肝细胞增殖再生的模型?3.通过CCK8实验发现,与对照组比较,10、50μmol/l AG490组细胞活力变化无统计学意义(P>0.05),余各组细胞活力均降低(P<0.01);与APAP组比较,AG490(10μmol/l)+APAP组的细胞活力无明显变化(P>0.05),AG490(50、100μmol/l)+APAP组的细胞活力均降低(P<0.01)?4.通过Western Blot实验发现,与对照组比较,APAP组p-STAT3的蛋白表达水平升高(P<0.01),而AG490组、APAP+AG490组均降低(P<值均0.05);与APAP组比较,APAP+AG490组PCNA、Cyclin D1蛋白表达的水平均降低(P值均<0.05)?5.通过RT-PCR实验发现,与对照组比较,APAP组PCNA、Cyclin D1 m RNA表达均PCNA、Cyclin D1 m RNA的表达水平均无明显变化(P>0.05),APAP组Ki67的m RNA的表达升高(P<0.01);与APAP组比较,APAP+AG490组PCNA、Cyclin D1、Ki67 m RNA表达均降低(P值均<0.01)?结论STAT3参与APAP诱导的小鼠肝细胞AML12损伤后的细胞增殖,而AG490作为STAT3抑制剂通过抑制STAT3磷酸化从而抑制APAP肝损伤后肝细胞增殖。