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研究背景聚焦超声消融手术(Focused Ultrasound Ablation Surgery,FUAS)或高强度聚焦超声(High Intensity Focused Ultrasound,HIFU)作为一种新型微无创技术已被广泛运用于肿瘤的治疗中。但是随着治疗深度的增加,超声的能量会发生衰减,所以HIFU治疗离不开增效剂。增效剂的种类有很多,大多是通过改变靶区的声环境来进一步实现增效HIFU的目的。但是现有的增效剂存在显影模式单一,靶向性不强的局限性,限制了其在临床上更为广泛的应用。显影模式单一则无法提供较为全面的肿瘤诊断信息,难以给HIFU提供较好的影像指导。靶向性不强则会使增效剂无法在靶区浓聚,易代谢,难以达到很好的成像和治疗效果。若增大HIFU治疗功率,则可能存在安全隐患,对正常组织造成损伤。所以,如何解决增效剂显影模式单一,靶向性不强这一现状,是目前研究的重点。目的通过制备一种由双歧杆菌(Bifidobacterium longum,B.longum)和包裹吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)与全氟己烷(Perfluorohexane,PFH)的阳离子脂质纳米粒(ICG and PFH coloaded cationic lipid nanoparticles,CL-ICG-PFH-NPs)共同构成的多功能生物靶向增效剂,利用其可以靶向多模态成像的特性,在介导HIFU治疗的同时协同HIFU增强对肿瘤的治疗效果,以提高HIFU治疗的有效性与安全性。方法1.制备CL-ICG-PFH-NPs,检测其基本理化性质。培养B.longum,革兰染色后于光镜下观察其形态,粒径仪检测其电位。构建生物靶向增效剂,共聚焦显微镜下观察B.longum与CL-ICG-PFH-NPs的连接情况,流式细胞术进一步量化二者的连接率。生物靶向增效剂的靶向性检测实验:建立裸鼠乳腺癌皮下移植瘤模型,连续三天尾静脉注射定量的B.longum,在注射后7天处死裸鼠,取肿瘤组织及重要器官制成组织切片并进行革兰染色,光镜下观察B.longum在各组织中的分布。为进一步验证肿瘤靶区的B.longum对CL-ICG-PFH-NPs具有滞留作用,使用DiI对CL-ICG-PFH-NPs进行标记,共聚焦显微镜下观察注射后不同时间段CL-ICG-PFH-NPs在肿瘤部位的分布富集情况。2.生物靶向增效剂体内外多模态显像实验:体外实验中将CL-ICG-PFH-NPs根据ICG浓度按梯度稀释,分别采集荧光,光声,超声图像并检测信号强度,评价其成像能力。体内实验中,建立乳腺癌皮下移植瘤模型。B.longum相关组在成像实验前七天,先连续三天注射定量的B.longum。在荧光成像实验中,将裸鼠分为三组:B.longum组,CL-ICG-PFH-NPs组,B.longum+CL-ICG-PFH-NPs组(生物靶向增效剂组),每组5只。在尾静脉注射CL-ICG-PFH-NPs后6 h,24h,48 h,72 h采集活体荧光图像。在光声成像与超声成像实验中,将裸鼠分为四组:PBS组,B.longum组,CL-ICG-PFH-NPs组,B.longum+CL-ICG-PFH-NPs组,每组5只。在尾静脉注射CL-ICG-PFH-NPs后0 h,6 h,24 h,48 h,72 h采集光声图像。在超声成像实验中,采集各组在808 nm激光辐照前后B模式和CEUS模式图像。于各成像系统中对各组肿瘤区域的信号进行定量分析。3.生物靶向增效剂增效HIFU治疗的实验研究:将20只荷瘤鼠随机分为四组,分别为PBS组,B.longum组,CL-ICG-PFH-NPs组,B.longum+CL-ICG-PFH-NPs组。对肿瘤进行点辐照(150 W,3 min),观察靶区灰度值变化,于辐照后24 h进行TTC染色,观察并计算凝固性坏死体积,能效因子。根据上述参数分析各组对于HIFU的增效效果。对肿瘤组织进行HE,PCNA,TUNEL免疫组化分析,评价消融效果。为验证生物靶向增效剂的安全性,采用CCK-8法检测CL-ICG-PFH-NPs对HUVECs的存活率影响。采集注射生物靶向增效剂后的血液样本,进行血常规与血生化检测。采集生物靶向增效剂组HIFU治疗后荷瘤鼠的重要器官组织,进行组织切片HE染色,评价生物靶向增效剂协同HIFU治疗的安全性。结果1.CL-ICG-PFH-NPs光镜下呈大小均一,分布均匀的球形,透射电镜下呈壳核性结构。平均粒径为318±17.3 nm,平均电位为28.4±4.71mV。测得ICG的包封率为74%,载药量为9.09 wt%。CL-ICG-PFH-NPs具有良好的光热性能与相变能力。革兰染色后的B.longum在光镜下呈蓝紫色长棒状,平均表面电位为-29.7±3.31 mV。连接率实验中,共聚焦显微镜下,B.longum周围粘附了大量CL-ICG-PFH-NPs,二者连接率高达98.67%,而对照组仅为3.73%。靶向性实验中,仅裸鼠肿瘤组织可见大量的B.longum。共聚焦显微镜下,肿瘤靶区均出现被DiI染色呈红色荧光的CL-ICG-PFH-NPs,但是生物靶向增效剂组肿瘤区域的信号强度更强,且在注射后48h到达峰值。2.体外荧光,光声,超声成像实验均证实了CL-ICG-PFH-NPs具有良好的多模态成像效果,且信号强度与ICG浓度呈线性正相关。体内实验中,生物靶向增效剂对肿瘤具有良好的特异靶向性,生物靶向增效剂组的信号强度远强于其余组。且荧光,光声信号强度在注射纳米粒48 h后到达峰值。在注射纳米粒后48 h,激光仪辐照肿瘤后,生物靶向增效剂组的超声信号强度远高于其余组(P<0.0001)。3.HIFU治疗实验结果表明,生物靶向增效剂组的灰度变化值与凝固性坏死体积均明显高于其余组(P<0.001),生物靶向增效剂组的EEF值与其余组相比差异有显著统计学差异(P<0.0001)。肿瘤组织切片的HE,PCNA,TUNEL免疫组化结果均显示,生物靶向增效剂组的肿瘤细胞凋亡最为显著。CCK-8检测结果与各项血常规血生化指标均正常。HIFU治疗后,生物靶向增效剂组的重要组织器官未见明显损伤。生物靶向增效剂协同HIFU治疗的有效性与安全性均得以验证。结论1.本课题成功构建了生物靶向增效剂,不仅拥有良好的理化性质还对肿瘤组织具有良好的靶向性。2.生物靶向增效剂具有良好的体内外多模态成像性能与增效HIFU的能力,不仅可以作为多模态显像剂用于肿瘤的诊断中,还可以在实时介导HIFU治疗的同时协同HIFU增强对肿瘤的治疗效果,有望在实现肿瘤精准诊断与治疗的同时,提高HIFU治疗的有效性与安全性。