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目的: 采用三气培养箱构建神经干细胞低氧损伤模型,通过MTT、AO/EB染色来观察细胞活性及形态的改变,并检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达与Bcl-2/Bax比率,探讨姜黄素是否对低氧诱导下的神经干细胞凋亡有影响。 方法: 选用C17.2小鼠源性神经干细胞作为实验对象,利用三气培养箱构建低氧损伤模型。第一阶段:观察低氧对神经干细胞活性的影响。1)把细胞分为4组:正常培养组,低氧6、12、24小时组,采用MTT检测不同低氧时间对细胞活力的影响。2)根据低氧时间MTT结果,在3个时间梯度进行AO/EB染色,观察神经干细胞形态变化,拍存图片。3)WB检测不同低氧时间(0、6、12、24小时)神经干细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达及Bcl-2/Bax比率变化情况。 第二阶段:观察姜黄素对低氧诱导下神经干细胞凋亡的影响。1)选取神经干细胞开始改变最明显的时间点作为第二阶段最佳实验时间,将神经干细胞分为4组,加入不同浓度的姜黄素(0、2.5、12.5、62.5)umol/L进行预处理,低氧培养,MTT法检测不同浓度姜黄素对细胞活力的影响。2)根据药物浓度MTT实验结果,选取细胞活性改变明显的3个时间梯度进行AO/EB染色,观察各组神经干细胞形态变化,拍存图片,最后采用WB检测加入不同浓度姜黄素预处理后神经干细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达及Bcl-2/Bax比率变化情况。 结果: 第一阶段:与正常组相比,低氧6小时组活性下降不明显(P>0.05),低氧12、24小时组细胞活性明显下降(P<0.05)。在显微镜下观察低氧培养下细胞数目减少,可见凋亡小体,随低氧时间延长,凋亡改变越明显。WB检测发现:与正常组相比,低氧12、24小时组Bcl-2蛋白表达量降低(P<0.05),Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量增多(P<0.05),Bcl-2/Bax比率降低(P<0.05),而低氧6小时组各蛋白表达变化不明显(P>0.05)。 第二阶段:选取低氧12小时作为第二阶段低氧作用时间。与低氧12小时组相比,加入2.5umol/l姜黄素预处理组细胞活性增强不明显(P>0.05),而加入12.5、62.5umol/L姜黄素预处理组细胞活性明显增强(P<0.05)。显微镜下发现姜黄素预处理组细胞数目增多。WB观察:与低氧12小时组相比,加入12.5、62.5umol/l姜黄素预处理组Bcl-2蛋白表达量增多(P<0.05),Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量减少(P<0.05),Bcl-2/Bax比率增高(P<0.05)。而加入2.5umol/l姜黄素预处理组各蛋白变化则不明显(P>0.05)。 结论: 姜黄素可拮抗低氧诱导的神经干细胞凋亡。其作用机制可能与其通过上调Bcl-2/Bax比率,下调Caspase-9及Caspase-3蛋白有关。