【摘 要】
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N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）是一种重要的功能性糖,由于其重要的生理功能,被广泛用于食品、医药和其他领域,需求不断上升。目前的生产方法存在一些问题难以解决,如天然产物提取法原料昂贵、化学法分离过程复杂、酶法合成成本高、全细胞催化法操作繁琐等,不利于Neu5Ac的大规模工业化生产。利用代谢工程手段建立稳定、高效的N-乙酰神经氨酸发酵生产体系,是进一步拓展N-乙酰神经氨酸市场的需求。本研究以实验室前
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N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）是一种重要的功能性糖,由于其重要的生理功能,被广泛用于食品、医药和其他领域,需求不断上升。目前的生产方法存在一些问题难以解决,如天然产物提取法原料昂贵、化学法分离过程复杂、酶法合成成本高、全细胞催化法操作繁琐等,不利于Neu5Ac的大规模工业化生产。利用代谢工程手段建立稳定、高效的N-乙酰神经氨酸发酵生产体系,是进一步拓展N-乙酰神经氨酸市场的需求。本研究以实验室前期构建的一株N-乙酰神经氨酸生产菌Escherichia coli NEU-2为出发菌株,从多方面增强前体物磷酸式烯醇式丙酮酸（PEP）的供应,获得了一株N-乙酰神经氨酸高产菌株。主要研究内容如下:（1）强化非PTS系统的葡萄糖摄取效率。在NEU-2的基础上过表达大肠杆菌自身的glk基因,获得菌株NEU-3。摇瓶发酵结果显示,NEU-3摄取葡萄糖的速率和原始PTS系统菌株NEU-0相差无几,且Neu5Ac产量比NEU-2提高了127.88%,达到11.28 g/L。（2）增强中心碳代谢过程中的PEP合成。在NEU-3中单独或组合过表达pps、pck基因,摇瓶发酵结果显示,同时过表达pps、pck基因对提升单位菌体Neu5Ac产量有正向作用。（3）利用弱启动子微调丙酮酸激酶的表达。将菌株NEU-3的丙酮酸激酶编码基因pyk F的天然启动子分别替换成弱启动子BBa＿J23103、BBa＿J23109和BBa＿J23116,得到NEU-8、NEU-9、NEU-10。此外,分别敲除菌株NEU-3的pyk F、pyk A基因用作对照。最终,敲除pyk A的菌株NEU-12以其生产和生长的优势,作为其中微调丙酮酸激酶效果最好的菌株。摇瓶发酵结果显示,NEU-12的Neu5Ac产量增长了18.46%,细胞生长未受到明显损害。（4）为减少发酵过程中的乙酸积累,本研究从敲除乙酸合成相关基因pox B、ack A和过表达乙酸利用基因acs两种角度出发,以NEU-12为出发菌构建了一系列工程菌。摇瓶发酵结果显示,敲除pox B基因和ack A基因的菌株在发酵过程中乙酸的积累量显著低于对照菌。（5）重组菌株NEU-12经摇瓶验证有较好的发酵性能,使用5 L发酵罐对其分批补料发酵培养。发酵结果显示,菌株NEU-12在5 L发酵罐中发酵40 h,Neu5Ac产量可达27.41 g/L,产量与生产强度超过目前报道的大肠杆菌中最高值。本研究针对大肠杆菌Neu5Ac合成过程中,前体物PEP供应不足限制目标产物合成效率提升的瓶颈问题,使用代谢工程策略对Neu5Ac生产菌进行合理的改造,最终获得了一株能够高效率合成Neu5Ac的大肠杆菌工程菌,产量和生产强度达到目前报道的大肠杆菌中的最高值。
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