微生物基因组精简是构建底盘细胞的重要手段,能够有效的去除细胞内冗余调控和代谢网络,降低基因组复杂度,减少非必需代谢途径的干扰,提高菌株对底物和能量的利用效率。本研究以敲除六种胞外蛋白酶基因的Bacillus amyloliquefaciens TCCC19030为研究对象,利用生物信息学挖掘非必需基因,通过不断地对基因组进行删减,构建了一系列基因组精简菌株,分析了不同程度的基因组精简对菌株生长的影响并探究了基因组精简菌株作为底盘细胞生产碱性蛋白酶的价值和潜力。首先对原始菌株B.amyloliquefaciens TCCC111018的基因组、转录组数据以及与NCBI、Uni Prot、anti SMASH、Islandviewer 4、Subti Wiki、BSub Cyc等数据库结合进行生物信息学分析,总结了5类非必需基因类型:次级代谢产物、胞外粘性物质、基因组岛、芽胞形成相关基因、鞭毛形成相关基因。这些基因序列长度达到873 kb,基因组占比超过21%。随后在菌株TCCC19030基础上,利用同源重组技术对核黄素、杆菌肽、细菌素、杆菌素、表面活性素、聚酮类物质等6种次级代谢产物合成基因簇,胞外多糖、聚谷氨酸、果聚糖等3个粘性物质合成基因簇,1个鞭毛合成基因簇和1个噬菌体合成相关基因簇进行缺失,获得了一系列精简菌株,其中精简最多的是TCCC112270,共计精简179.14 kb,基因组占比4.5%。基因组简化菌株的生理表型结果显示,单功能基因簇缺失菌株中大部分菌株与出发菌株无明显差异,但缺失细菌素、杆菌素和鞭毛合成相关基因簇的菌株表现出生长后期衰亡速度加快的现象;而在不同精简程度的菌中,基因组精简越多的菌株在生长后期表现出衰亡速度越快的趋势。对不同基因组精简程度的菌株的碱性蛋白酶表达能力进行了考察,发现精简了果聚糖相关基因簇的菌株对碱性蛋白酶的表达有较大影响,即在精简了胞外多糖、聚谷氨酸和果聚糖合成相关基因簇的菌株TCCC112255引入碱性蛋白酶表达盒后,酶活力在摇瓶中达到22523.73 U/m L,利用7 L发酵罐放大培养,高产酶时期长达36 h,酶活最高为96783.17 U/m L,较对照菌株提升约20%,而其余精简菌株的碱性蛋白酶的表达量无显著变化。在菌株TCCC112255的基础上进一步缺失了胞内分子伴侣的阻遏蛋白编码基因hrcA和磷脂酰丝氨酸合酶编码基因pssA,旨在进一步提升菌株对碱性蛋白酶的分泌。结果显示敲除菌的延滞期延长,生物量降低,在衰退期的菌株自溶速度加快,但发酵验证结果显示hrcA和pssA双敲除菌株TCCC19046的碱性蛋白酶相对酶活较TCCC112212提升8.71%。对转录水平的检测证明了双重缺失hrcA和pssA可以使碱性蛋白酶apr E的转录水平增加,有助于酶活力提升,说明通过过表达胞内分子伴侣的策略来构建高产碱性蛋白酶细胞工厂是可行的。