脑性瘫痪（cerebral palsy,CP）简称脑瘫,它是一种非进行性的脑损伤综合征,常常发生在出生前后一个月内,由于多种因素导致,大多表现为运动障碍和姿势异常,伴有认知障碍等。近年来,随着围产医学、医疗技术的发展和二胎政策的放宽,婴幼儿出生率增加,死亡率下降,发病率呈现逐年增高的趋势,而且脑瘫已成为导致儿童残疾的主要疾病。它一方面危害婴幼儿自身的健康,另一方面也加重了家庭和社会经济负担。目前认为,脑瘫的发生是由产前、产中和产后多种因素导致,其中缺血缺氧、感染与炎症、早产/低体重儿以及新生儿黄疸等是主要的高危因素。脑瘫的主要病理改变是脑白质的损伤,并常伴有认知功能的损害。在缺血缺氧、感染及炎症等因素引发脑瘫的过程中,一方面会激活脑内的小胶质细胞,另一方面由于血脑屏障的损伤导致外周的中性粒细胞和巨噬细胞会通过血脑屏障进入脑内,这些机体的固有免疫细胞会产生炎症反应。而脑瘫后损伤的脑细胞表面存在损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern,DAMP）,可以被免疫细胞（含模式识别受体）识别,进而启动免疫应答。NOD样受体家族（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor,NLR）是模式识别受体中的一种,其中NLRP3是近年来NLRs家族中备受关注的一个分子。当NLRP3被激活后通过与衔接蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing）和募集pro-caspase-1形成NLRP3炎症复合体,启动细胞焦亡（Pyroptosis）。细胞焦亡是一种依赖Caspase的细胞死亡方式。细胞焦亡通过剪切无活性的pro-caspase-1成为有活性的Caspase-1,进而激活gasdermin D（GSDMD）并促使IL-1β和IL-18的生成,最终引发细胞膨胀、破裂和细胞内容物的释放,形成局部炎症。因此,细胞焦亡属于细胞炎症坏死,参与了缺血缺氧性脑损伤、脑出血等多种疾病的病理生理学过程。本研究通过复制新生鼠缺血缺氧性脑病的动物模型,观察细胞焦亡在脑瘫发病过程中的作用。同时对缺血缺氧性脑损伤的幼鼠给予脊柱推拿干预,观察脊柱推拿对脑瘫幼鼠的学习记忆损伤的改善作用,并从细胞焦亡的角度探讨脊柱推拿对于脑瘫后认知功能损伤的改善作用机制。研究目的:在脑瘫动物模型上给予脊柱推拿,观察推拿通过抑制脑瘫幼鼠海马中的NLRP3表达及其诱导的细胞焦亡改善脑瘫幼鼠的认知功能损伤。研究方法:30只雄性SD新生大鼠随机分为:假手术组（Sham group）、模型组（Model group）和推拿组（Tuina group）,每组10只。模型组和推拿组幼鼠于出生后第7天结扎并凝断左侧颈总动脉,并于术后给予2.5小时的低氧（8%的O2和92%的N2）处理,假手术组幼鼠于出生后第7天仅给予颈部切口和左侧颈总动脉的分离。所有幼鼠在术后均送回母鼠喂养。推拿组幼鼠从术后第2天开始至出生后第49天每天给予脊柱推拿,每天推拿1次。各组幼鼠从出生后第3天开始至出生后第49天每两天称重一次;出生后第40天至第43天进行平衡木实验检测;出生后第44天至第45天进行明暗箱实验检测;出生后第46天至第50天进行Morris水迷宫实验检测。所有实验幼鼠于出生后第50天进行取材,分别应用免疫组织化学检测幼鼠海马中NLRP3的表达变化,应用Western blot检测海马中NLRP3、Caspase-1、cleaved-Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的蛋白表达变化。研究结果:1.模型组和推拿组幼鼠在出生后第7、9、11、13、15、25天的体重均显著低于假手术组（相应时间点均为p<0.05）,出生后第27、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49天模型组幼鼠的体重仍显著低于假手术组（相应时间点均为p<0.05）,而推拿组幼鼠的体重均显著高于模型组（相应时间点均为p<0.05）,但是推拿组幼鼠的体重与假手术组相比差异无显著性（相应时间点均为p>0.05）。2.在平衡木实验中,假手术组、模型组和推拿组幼鼠通过平衡木的时间分别是（5.10±0.99）秒、（21.80±15.32）秒和（7.22±3.22）秒,与假手术组相比模型组幼鼠通过平衡木的时间显著增加（p<0.05）,与模型组相比推拿组幼鼠通过平衡木的时间显著减少（p<0.05）,而假手术组和推拿组之间无显著性差异;三组幼鼠在通过平衡木的过程中后肢打滑次数分别是（0.10±0.32）次、（3.00±1.25）次和（1.50±1.08）次,与假手术组相比模型组和推拿组幼鼠通过平衡木后肢打滑次数均显著增加（两组的p值均为p<0.05）,但推拿组幼鼠的后肢打滑次数显著低于模型组（p<0.05）。3.在明暗箱实验中,假手术组、模型组和推拿组幼鼠进入暗箱的次数分别是（0.90±0.88）次、（6.10±1.66）次和（3.40±1.71）次,与假手术组相比模型组和推拿组幼鼠进入暗箱次数显著升高（两组的p值均为p<0.05）,但推拿组幼鼠进入暗箱次数显著少于模型组（p<0.05）;三组幼鼠第一次进入暗箱的潜伏期分别是（133.10±43.16）秒、（29.30±14.87）秒和（58.50±24.04）秒,与假手术组相比模型组和推拿组幼鼠的潜伏期显著缩短（两组的p值均为p<0.05）,而模型组和推拿组之间无显著性差异。4.在Morris水迷宫实验中,假手术组、模型组和推拿组幼鼠找到平台潜伏期分别是（6.38±2.55）秒、（34.17±10.16）秒和（17.82±3.65）秒,与假手术组相比模型组和推拿组幼鼠的潜伏期显著升高（两组的p值均为p<0.05）,但推拿组幼鼠的潜伏期显著低于模型组（p<0.05）;三组幼鼠滞留于小平台所在象限的滞留时间百分比分别是（63.46±12.51）%、（30.27±15.24）%和（43.41±9.21）%,与假手术组相比模型组和推拿组幼鼠的平台所在象限滞留时间百分比显著降低（两组的p值均为p<0.05）,但推拿组幼鼠的平台所在象限滞留时间百分比显著高于模型组（p<0.05）。5.免疫组织化学检测NLRP3的表达,结果显示NLRP3主要表达与细胞胞浆中。Western blot检测海马组织中NLRP3的表达变化,结果显示模型组幼鼠海马中NLRP3的表达显著高于假手术组和推拿组（两组的p值均为p<0.05）,推拿组幼鼠海马中NLRP3的表达显著低于模型组（p<0.05）,而推拿组幼鼠海马中NLRP3的表达与假手术组无显著差异。6.Western blot检测三组幼鼠海马组织中Caspase-1的表达变化,结果显示与假手术组相比模型组和推拿组幼鼠海马中Caspase-1的表达均显著升高（两组的p值均为p<0.05）,模型组和推拿组相比两组间无显著性差异;但是具有活性的cleaved-Caspase-1在三组幼鼠的海马组织中表达量与Caspase-1不同,模型组和推拿组幼鼠海马中cleaved-Caspase-1的表达均显著高于假手术组（两组的p值均为p<0.05）,但推拿组的cleaved-Caspase-1表达水平显著低于模型组（p<0.05）。7.假手术组、模型组和推拿组幼鼠海马中GSDMD、IL-1β和IL-18表达经Western blot检测后呈现相同的变化,即模型组和推拿组幼鼠海马中GSDMD、IL-1β和IL-18的表达均显著高于假手术组（两组的p值均为p<0.05）,但推拿组GSDMD、IL-1β和IL-18表达水平又显著低于模型组（p<0.05）。研究结论:1.脊柱推拿可以明显改善脑瘫幼鼠的生长发育,并促进脑瘫幼鼠运动平衡能力的恢复。2.脊柱推拿可以明显改善脑瘫幼鼠的认知功能。3.脑瘫幼鼠经过脊柱推拿干预后,海马中NLRP3的表达下调,并导致脑瘫后海马中的细胞焦亡受到抑制。