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脆性X相关震颤/共济失调综合征(Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, FXTAS)是在脆性X综合征前突变携带者中发现的一种神经退行性疾病。FXTAS最常见的临床表现为伴有共济失调的进行性运动震颤。FXTAS的主要神经病理标记为广泛存在于大脑神经元、星形胶质细胞及脊髓内的嗜酸性、泛素化的核内包涵体。以前的研究提示FXTAS是一种RNA介导的神经退行性疾病,并有一些实验证据表明,rCGG前突变重复序列可能会募集某些特异RNA结合蛋白Purα、hnRNP A2/B1和CUGBP1,影响这些蛋白的正常功能,从而促进这种神经退行性疾病的发生。最近的全基因组研究表明,哺乳动物基因组中只有不到2%的基因为蛋白质编码区域,绝大多数基因产生成千上万具有调节功能的非编码元件,包括非编码RNA、转座子、简单串联重复序列、假基因、调控元件等。各种证据表明,这些非编码元件通过复杂的网络途径,在转录和转录后调节以及染色质修饰等方面发挥着重要和多样化的作用。越来越多的证据表明这些非编码元件的突变或失调与人类疾病间的关系更加密切,特别是近年来有大量报道阐述了非编码RNAs参与了某些神经退行性疾病的发生机制。本研究利用分子生物学和遗传学技术探讨了非编码元件在FXTAS发病机制中的可能作用,特别是小分子非编码RNA,如microRNA-277的失调和特异反转录转座子,如gypsy的激活在脆性X前突变rCGG介导的神经退行性病变中的机制。一、MicroRNA-277促进脆性X前突变rCGG介导的神经退行性病变1.脆性X前突变rCGG重复序列影响脑内miRNA表达为了研究脆性X前突变rCGG重复序列是否会影响脑内miRNAs的表达,我们利用rCGG前突变转基因果蝇来检测了目前已知的72种miRNAs的表达水平。结果发现,和对照组相比,在rCGG60转基因果蝇脑内,某些miRNAs的表达水平呈一致性改变。其中七种miRNAs的表达水平增加了2倍或2倍以上,两种miRNAs的表达水平降低50%或50%以上以上。这些结果提示脆性X前突变rCGG重复序列会引起脑内某些特异miRNAs的表达失调。2.MiR-277增强脆性X前突变rCGG重复序列引起的神经退行性病变为了探讨失调的miRNAs在FXTAS果蝇脑内所可能参与的作用,我们研究了特异miRNA和rCGG介导的神经毒性之间的相互作用。果蝇杂交结果显示,过表达miR-277增强rCGG介导的神经退行性病变。为了进一步探讨miR-277在rCGG介导的神经退行性病变中的潜在调节机制,我们构建了“miR-277海绵(miR-277 sponge, miR-277SP) "转基因果蝇来阻断miR-277的活性,结果显示,lniR-277SP可以抑制rCGG介导的神经细胞毒性,提示阻断miR-277活性可以减轻脆性X前突变rCGG重复序列引起的神经退行性病变。3.MiR-277通过不同机制调节其靶点Drep-2和Vimar的表达为了进一步揭示miR-277调节rCGG-介导的神经退行性病变的机制,我们参照TargetScanFly5.1,找出了miR-277的候选靶基因,进而通过观察rCGG-介导的神经退行性病变眼部表型的变化进行遗传学筛选以确定可以调节rCGG所介导神经退行性病变的miR-277靶点。通过筛选,发现了DNA片段化因子相关蛋白2(DNAfragmentation factor-related protein 2, Drep-2)和Vimar是两个rCGG所介导神经退行性病变的调节因子。Drep-2部分功能缺失会增加rCGG介导的神经退行性病变,而过表达Drep-2则可以减轻rCGG介导的退行性病变;Vimar功能的缺失也会加重rCGG介导的神经退行性病变眼表型。接着通过3’-UTR双重荧光素酶报告实验,进一步验证了Drep-2和Vimar确实是miR-277的靶点。此外,对rCGG转基因果蝇脑内Drep-2和Vimar表达水平的检测显示,与正常对照组相比,rCGG转基因果蝇脑内内源性Drep-2 mRNA水平有显著降低,而Vimar mRNA表达则水平没有明显改变。由此表明miR-277可能通过不同途径对Drep-2和Vimar进行调节,MiR-277对Drep-2的调节主要是在mRNA水平,而对Vimar的调节可能是在蛋白翻译水平。4. rCGG结合蛋白hnRNP A2/B1调节miR-277的表达我们以前的实验证实了两种RNA结合蛋白Purα和hnRNP A2/B1能与rCGG直接结合并调节rCGG介导的神经细胞毒性。最近的研究表明多个异构核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs)可与异染色质蛋白1(Heterochromatin Protein 1, HP1)相互作用和与基因组DNA结合来调节异染色质的形成。我们在miR-277上下游6kb的范围内用hnRNP A2/B1特异染色质免疫沉淀技术(ChIP)发现,在miR-277上游1.5kb的区域有超过7倍量的hnRNP A2/B1富集。这些结果表明hnRNP A2/B1可以直接和miR-277的上游区域直接结合对miR-277进行调节。上述分子生物学和遗传学实验结果提出了一个新的miRNA途径所介导的调节机制在FXTAS发病机理中的作用,研究这些miRNAs及其目标基因在FXTAS以及其他神经退行性疾病中的作用可为发现干预治疗这些疾病的潜在靶点提供依据。二、gypsy激活促进脆性X前突变rCGG介导的神经退行性病变1.脆性X前突变rCGG重复序列引发特异反转录转座子激活我们在对rCGG转基因果蝇进行基因谱表达分析时观察到了数个反转录转座子的一致上调。基于这一发现,我们在FXTAS果蝇模型中用定量PCR的方法系统地检测了这些反转录转座子的表达。结果显示,与对照组相比,在rCGG转基因果蝇中,I-element、gypsy、copia和mst40等反转录转座子的表达水平显著增加,并发现在rCGG剂量降低时,gypsy和copia的增加程度有所减少,且I-element和mst40表达量并没有明显升高。这些结果表明,rCGG转基因果蝇内特异反转录转座子的表达增加是呈rCGG重复序列剂量依赖性的。2.HnRNP A2/B1与HP1相互作用抑制gypsy和copia活性为了明确反转录转座子的激活在rCGG介导的神经退行性病变中的作用,我们进一步研究了特异转座子和rCGG介导的神经毒性之间的遗传相互作用。我们将突变flamenco果蝇与rCGG转基因果蝇进行杂交,结果发现,突变flamenco果蝇体内升高的gypsy增强了rCGG转基因果蝇眼部神经退行性病变的表型,这提示gypsy的激活可以直接增强rCGG所介导的神经退行性病变。另外有研究表明,HP1作为异染色质中重要的保守成分,对于反转录转座子的调节发挥着重要作用,而且HP1已被证明可与多个异构核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs)相互作用而调节异染色质的形成。鉴于我们以前发现的rCGG结合蛋白hnRNP A2/B1可缓解rCGG诱导的神经细胞毒性,我们观察了HP1与hnRNP A2/B1蛋白之间的潜在关联。通过免疫共沉淀技术发现,hnRNP A2/B1与HP1之间确有相互作用。鉴于先前的染色质免疫沉淀(ChIP)实验表明HP1可以与大多数flamenco元件相互作用以调控反转录转座子的活性,于是我们对hnRNP A2/B1是否也具有调控反转录转座子活性的进行了观察。通过ChIP实验,我们发现hnRNP A2/B1与copia和Mst40具有明显的相互作用,并且这三种反转录转座子在脆性X rCGG转基因果蝇中表达增高。而hnRNP A2/B1与那些在rCGG转基因果蝇中表达没有改变的反转录转座子没有明显相互作用。另外我们还观察到,过表达hnRNPA2/B1对对照组果蝇脑内gypsy表达没有影响,但可抑制rCGG转基因果蝇脑内升高的gypsy表达水平,在copia的表达中也观察到了同样的抑制作用。以上免疫共沉淀实验、ChIP检测和基因研究结果表明,hnRNP A2/B1可以选择性结合反转录转座子并且募集具有沉默转座子功能的HP1。在rCGG转基因果蝇模型中,hnRNP A2/B1被过多的rCGG重复序列所募集;具有活性功能的hnRNP A2/B1的消耗导致了与含有这些反转录转座子的基因组区域相互作用的HP1蛋白的减少,从而引起了反转录转座子的激活。3.沉默gypsy抑制脆性X前突变rCGG重复序列引起的神经细胞毒性为了进一步探讨反转录转座子的活性在脆性X rCGG前突变介导的神经退行性疾病中的相关作用,我们将针对gypsy或copia的dsRNAs转基因果蝇与rCGG转基因果蝇进行杂交后发现,沉默gypsy的表达而不是沉默copia的表达可抑制rCGG介导的神经退行性病变,而这些dsRNAs对对照组果蝇的眼没有影响。这一观察结果更加有力地表明,反转录转座子的活性失调在rCGG介导的神经毒性的分子发病机制中起着重要作用。本部分的分子生物学和遗传学的实验结果揭示了反转录转座子在FXTAS发病机理中的新作用,然而转座子的激活是否是一般神经退行性疾病的一个共同机制有待进一步探讨。