细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）是一类血红素结合蛋白超家族，存在于各种生命机体中。哺乳动物肝微粒体的P450酶系主要负责生物体内源性物质的代谢、合成及外源性物质的I相代谢。P450在体内的表达水平、组织分布及P450的代谢特异性等特征很大程度决定了药物在机体的消除速率、代谢物的性质与种类。药物在机体产生的药理作用、毒性反应及残留时间和残留水平与 P450密切相关。因此畜禽体内P450表达和功能特点研究不仅对畜禽药物的合理使用具有指导意义，更能辅助兽药休药期的制定，从而避免残留风险。　　哺乳动物体内参与药物、毒物、环境污染物等外源性物质代谢的P450主要是1、2和3家族的成员。其中CYP3A亚家族成员负责了60%以上外源物质的代谢与体内清除。CYP3A4是人体内含量最高，代谢药物最为广泛的药物代谢P450亚型酶之一，很多药物的口服生物利用度、体内清除速率及生物激活均与之有关。猪的肝脏和小肠存在典型的 CYP3A4样活性，而纯化的微型猪CYP3A蛋白的主要成分为CYP3A29，提示猪的CYP3A29亚型在猪外源物质的代谢中的作用很可能与CYP3A4在人体内的作用同样地重要。目前关于猪CYP3A29的表达、组织分布的研究尚未有报道，关于其活性特点研究均停留在微粒体的水平，CYP3A29结构与功能关系的报道更是一片空白。因此本课题首先考察猪体内主要药物代谢P450酶在肝、肾等组织中的表达分布，确定猪体内主要表达的P450酶成员；然后克隆、异源表达猪体内含量最丰富的P450亚型CYP3A29的cDNA序列，比较重组表达的CYP3A29与猪肝微粒体和人CYP3A4的探针活性的异同，阐明猪重要药物代谢P450酶CYP3A29的功能活性特点；接着，通过对常用兽药、频繁暴露的毒素在CYP3A29代谢系统中的代谢产物的鉴定，推测CYP3A29所参与的反应，从而揭示CYP3A29在猪的药物代谢与毒物解毒过程中的重要作用；最后，利用定点突变技术，异源表达并鉴定CYP3A29突变体蛋白活性，揭示关键氨基酸对CYP3A29功能的影响，初步探索CYP3A29结构与功能的关系。　　1．猪P450酶mRNA的组织表达　　Trizole试剂提取猪心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、空肠、回肠等组织的总RNA，DNA酶处理后，以内参基因β-actin内含子区域引物进行PCR扩增，排除总RNA样品的DNA污染；琼脂糖凝胶电泳和260nm光谱分析分别检测总RNA样品的完整性和浓度。以总 RNA为模板，在M-MLV反转录酶的作用下合成cDNA。分别以cDNA和SYBR GreenⅠ嵌入式荧光染料作为模板和检测信号介质，对猪主要P450基因（CYP1A2、CYP2A19、CYP2C49、CYP2D25、CYP2E1和CYP3A29）在猪的心、肝、脾、肺、肾和十二指肠等组织，及 CYP3A亚型（CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A46）在肝、十二指肠、空肠和回肠中的mRNA表达水平进行定量分析。　　Real-time PCR结果表明，所有组织中均表达上述P450基因的mRNA，其中肝脏组织中各P450 mRNA的表达最高，其次是十二指肠和肺。在肝中，转录表达最高的基因是 CYP3A29，其次是CYP2E1；在十二指肠粘膜中，转录表达最高的是CYP3A29，次高的是CYP2C49。4个CYP3A亚型在小肠均呈现梯度下降的趋势，十二指肠表达较高，回肠表达较低。其中，CYP3A29在肝脏和小肠均呈最高的转录表达，CYP3A22在肝脏和小肠转录水平次高。本研究首次全面地阐明了猪药物代谢P450酶在各组织中的转录情况，从mRNA表达水平分析药物代谢酶在猪体内的分布特征，揭示了肝脏和小肠在药物代谢中的重要作用，筛选确立了猪体内参与药物代谢的重要P450酶，为猪用药物代谢研究提供数据参考。　　2.猪CYP3A29的克隆、表达及活性特点研究　　以cDNA为模板，分别用猪CYP3A29、猪NADPH-P450还原酶（pig NADPH-reductase,pNPR）和猪细胞色素b5（pig cytochrome,pb5）基因特异性引物进行PCR扩增，分离获得CYP3A29、pNPR和pb基因的全长编码序列。通过pFastBac1重组质粒的构建、同源转座及重组粘粒的转染，获得包含有CYP3A29、pNPR和pb5编码序列的重组病毒。Sf9昆虫细胞经病毒共感染，表达CYP3A29、pNPR和pb5。Western blot确证CYP3A29的表达，CO差示光谱、细胞色素C还原光谱和连二亚硫酸还原光谱法分别测定CYP3A29、pNPR和pb5的含量。以硝苯地平和睾酮作为探针、酮康唑和醋竹桃霉素为抑制剂，分别测定CYP3A29的代谢动力学参数（最大初速度（Vmax）、米氏常数（Km）和体外固有清除率（CLint））和抑制IC50值，并与人重组CYP3A4和猪肝微粒体的测定值进行比较。　　异源表达结果显示，CYP3A29能以有活性的全酶形式在Sf9昆虫细胞中表达。重组CYP3A29代谢硝苯地平和睾酮的Vmax值与人CYP3A4和猪肝微粒体的接近。代谢硝苯地平动力学常数Km值分别为人CYP3A4的3倍和肝微粒体的1/2，CYP3A29对硝苯地平的CLint值为CYP3A4的1/4，为猪肝微粒体的1.7倍。CYP3A29代谢睾酮的动力学常数Km值为人CYP3A4的1.3倍，为猪肝微粒体的1/2，睾酮在猪CYP3A29和人CYP3A4的CLint值非常接近，均较猪肝微粒体高。酮康唑、醋竹桃霉素等CYP3A亚型酶特异的抑制剂对CYP3A29活性产生一定的抑制影响。抑制动力学研究表明，酮康唑对重组CYP3A29、CYP3A4和猪肝微粒体硝苯地平氧化、睾酮6β-羟化活性的抑制IC50值接近，且均比醋竹桃霉素对三个系统的硝苯地平、睾酮6β-羟化活性的抑制IC50值低。比较三个系统，酮康唑对人重组表达CYP3A4介导的睾酮6β-羟化活性显著低于猪肝微粒体；醋竹桃霉素对人重组表达CYP3A4介导的硝苯地平氧化和睾酮6β-羟化活性的抑制IC50值均显著低于猪肝微粒体和重组猪CYP3A29。本研究首次通过异源表达的方式获得可用于药物代谢研究的CYP3A29体外代谢系统，并使用CYP3A4探针药物和抑制剂比较了CYP3A29、猪肝微粒体和CYP3A4酶学特征的异同。该数据从深层面反映了猪CYP3A29的酶学种属特征，揭示了药物代谢研究种属外推的风险性。　　3．兽药及毒素在CYP3A29体系中的代谢　　将合适浓度的阿莫西林、替米考星等兽药，黄曲霉FB1、T-2等毒素分别与重组表达CYP3A29系统孵育90min。2倍反应体积的乙腈沉淀蛋白、15000rpm离心20min，上清液经0.22μm滤膜过滤后进行LC/MS-ITTOF分析。　　通过对代谢物的分析与鉴定，本研究发现，替米考星、泰乐菌素、达氟沙星、林可霉素、甲氧苄啶、阿苯达唑、地塞米松、黄曲霉素FB1、T-2和HT-2等参试化合物均可被CYP3A29代谢，占所有考察化合物的50%。其中替米考星、达氟沙星、甲氧苄啶等药物在CYP3A29孵育系统中主要发生N（O）-脱甲基反应和C-羟化反应；泰乐菌素则只发生N-脱甲基反应；林可霉素、阿苯达唑发生S-氧化反应；地塞米松、黄曲霉素和HT-2主要发生C-羟化；T-2除了发生羟化反应，还发生C-8位的酯水解反应。检测到的19个代谢反应过程中，42%为N-或者O-脱甲基化，37%的反应为C-羟化反应，S-氧化、脱氢氧化和酯水解反应分别占5%、5%和11%。本研究结果提示，CYP3A29参与了广泛的、结构不同的化合物的代谢，且代谢反应类型多样。该数据加深了研究者对CYP3A29功能活性的理解，同时为兽药改造与研发和毒物毒性机制研究提供新思路。　　4．点突变对CYP3A29功能的影响研究　　通过与CYP3A4的同源比对、蛋白质一级结构、二级结构和底物识别位点及高级结构的比较，推测207、210、211、239、244、304、305、371、376、479、480和483等位点氨基酸可能与CYP3A29功能活性密切相关。利用位点突变技术分别构建S207T、L210A、L210A/L211A、L211A、T239C、S244E、F304W、A305S、A305F、A371M、A376V、T479S、T479L、Q480G、T483L和T483I等突变体，再将突变体表达于Sf9昆虫细胞。以睾酮、硝苯地平作为探针底物，分别考察CYP3A29突变体蛋白相对野生型蛋白代谢活性的变化。　　动力学分析结果显示，S244E、A371M显著增加了CYP3A29代谢硝苯地平的CLint值，F304W和A305F则分别降低了其CLint值。而L211A、S244E显著提高了CYP3A29代谢睾酮的CLint值，L210A、F304W、A305F分别降低了睾酮的CLint值。L210A能降低睾酮6β-羟化物的产量，增加2β-羟化产物的产量，从而导致6β-/2β-产物比例的降低。该结果提示，L211、S244、A371、F304、F305等位点氨基酸很可能与CYP3A29的睾酮和硝苯地平氧化能力有关；CYP3A29的硝苯地平氧化结构域与睾酮6β-羟化结构域位点可能有所区别；此外，L210位点氨基酸可能与CYP3A29对睾酮的立体选择性密切相关。该研究结果将有助于CYP3A29三维结构的解析，结构与功能关系的阐明和CYP3A29与底物作用的分子机制的解释。　　综上所述，本研究从分子水平揭示了猪肝脏和小肠作为重要的药物代谢与解毒器官的本质。在肝脏和十二指肠中，CYP3A29的表达远比其他亚型高，表明了其在药物代谢中的重要角色。CYP3A29为猪体内与人CYP3A4功能性相似的同源蛋白，并且可能贡献了绝大部分猪肝微粒体的CYP3A活性。猪CYP3A29的组织分布研究为解释CYP3A介导的生物转化的药物在肝脏和小肠的首过代谢和低生物利用度提供分子基础，并提示我们，在制定兽药的临床给药方案时，应充分考虑口服药物在肝脏和小肠中由CYP3A介导的首过代谢和CYP3A抑制剂引起的药物相互作用。本研究所建立的异源表达的CYP3A29代谢体系，为新药开发的药理学和毒理学研究提供了一个新的体外代谢模型。在猪肝微粒体中，表现较低的Km、Clint值的硝苯地平氧化活性可作为CYP3A的探针活性，用于兽药研发。具有较低IC50值的酮康唑则可作为猪肝微粒CYP3A活性特异性的抑制剂，用于兽药在猪代谢路径的探索。本研究首次利用重组表达的P450酶调查了数类兽药和毒素在CYP3A29的代谢，进一步验证了本研究构建的异源表达代谢系统可成功用于药物的体外代谢研究，揭示了CYP3A29在猪异物代谢的重要意义，为这些药物的体内代谢研究奠定基础，为药物改造和新药开发提供理论依据；同时也为毒素的毒作用机制分析提供新思路。最后，定点突变实验间接地阐明了CYP3A29结构与功能的关系，为CYP3A29蛋白质的结构解析提供证据，为解释其广泛的底物谱和代谢类型多样性的机制提供数据支撑。