【摘 要】
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目的:探讨miR-29b和PI3K/AKT通路对肾脏间质纤维化的调节机制,并进一步研究其对肾小管上皮细胞转分化过程的调节作用。方法:第一部分:体内实验:CD-1小鼠适应性饲养一周后,结扎单侧输尿管构造单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Occlusion,UUO）模型,小鼠分为5组:（1）Sham组（N=12）;（2）UUO+vehicle（N=12）;（3）Sham+LY29
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目的:探讨miR-29b和PI3K/AKT通路对肾脏间质纤维化的调节机制,并进一步研究其对肾小管上皮细胞转分化过程的调节作用。方法:第一部分:体内实验:CD-1小鼠适应性饲养一周后,结扎单侧输尿管构造单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Occlusion,UUO）模型,小鼠分为5组:（1）Sham组（N=12）;（2）UUO+vehicle（N=12）;（3）Sham+LY294002 30 mg/kg day（N=12）;（4）UUO+LY294002 3 mg/kg day（N=12）;（5）UUO+LY294002 30mg/kg day（N=12）。分别在造模后的第7天、14天处死各组小鼠,收集手术侧肾脏组织,一部分肾组织用多聚甲醛固定,用于HE、Masson、免疫组化染色;另一部分肾组织在-80℃液氮中保存,Western Blotting和PCR检测E-Cadherin,α-SMA,PI3K,AKT,p-PI3K,p-AKT,miR-29b表达水平。第二部分:体外实验:（1）用浓度为10n M、100n M、1000n M的Ang II分别刺激NRK52E细胞24h;（2）用浓度为100n M的Ang II分别刺激NRK52E细胞0h、12h、24h、48h;（3）用浓度为100n M的Ang II诱导NRK52E细胞24h,采用浓度为100n M、500n M、1000n M LY294002诱导细胞;（4）运用细胞转染技术,胞内转染miR-29b mimic及miR-29b inhibitor,来改变细胞内miR-29b表达水平。提取各组细胞总RNA和总蛋白,然后通过RT-PCR和Western Blotting技术检测细胞E-Cadherin和α-SMA的表达,观察不同刺激条件对细胞表型蛋白表达水平的影响。检测各组中PI3K,AKT,p-PI3K,p-AKT,miR-29b的表达水平,验证不同刺激条件对信号通路和miR-29b的影响。（5）构建miRNA荧光素酶报告载体,并将突变型或野生型PIK3R2基因3’UTR（mut-PIK3R2,wt-PIK3R2）克隆插入,并与cont-miR-mimic或miR-29b mimic一起共转染到细胞内,然后检测荧光素酶的活性。结果:1.对比Sham假手术组,HE染色结果显示,UUO第7天梗阻的肾脏显示了肾皮质变薄,肾小管扩张,小管上皮细胞萎缩和间质增宽,炎症细胞浸润。腹腔注射LY294002（30mg/kg day）显著缓解UUO后的肾小管损伤。Masson染色显示UUO后间质蓝色胶原纤维沉积明显,在UUO+LY294002 30mg/kg组小鼠的肾脏中胶原纤维沉积减少。2.与Sham假手术组相比,UUO组肾组织中E-Cadherin表达下调,α-SMA表达上调;p-PI3K,p-AKT表达上调;miR-29b表达下调;UUO+LY29400230mg/kgday组的肾脏纤维化程度明显减轻,肾组织中E-Cadherin表达上调,α-SMA表达下调;p-PI3K,p-AKT表达下调。3.与对照组相比,浓度为10n M、100n M、1000n M Ang II诱导NRK52E 24h后,Ang II浓度越高,α-SMA表达水平越高,E-Cadherin表达水平越低。Ang II浓度越高,miR-29b表达水平越低。用浓度为100n M的Ang II刺激NRK52E 12h、24h、48h后,Ang II刺激时间越长,α-SMA表达水平越高,E-Cadherin表达水平越低。Ang II刺激细胞后,PI3K蛋白表达水平升高,p-AKT蛋白上调。用浓度为100n M、500n M、1000n M LY294002抑制信号通路后,与对照组相比,α-SMA表达下调,E-Cadherin表达上调。4.细胞内转染miR-29b mimic后,抑制了α-SMA表达,上调E-Cadherin表达,抑制了PI3K,p-AKT表达;细胞内转染miR-29b inhibitor后,上调α-SMA表达,抑制E-Cadherin表达,上调PI3K,p-AKT表达。与对照组相比,荧光素酶报告载体活性结果提示,miR-29b与野生型PIK3R2基因3’UTR结合后,荧光素酶活性明显降低。结论:1.在体内试验中miR-29b,PI3K/AKT通路,肾小管上皮细胞EMT参与肾脏间质纤维化过程。2.在细胞水平明确miR-29b通过调节PI3K/AKT通路抑制EMT过程的分子机制。3.分别在体内和体外阐释miR-29b对肾小管上皮细胞PI3K/AKT信号通路的调控,为miR-29b作为肾间质纤维化的治疗新靶点提供科学依据。
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