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目的:研究RMP(RPB5 Mediating Protein)在化疗药物顺铂诱导的肝癌细胞凋亡中的作用及其分子机制。方法:1.HepG2细胞经不同剂量顺铂(0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml)处理48h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况,确定顺铂最佳使用浓度。2.HepG2及过表达RMP(RMPo)、干扰RMP(RMPi)细胞株细胞经12μg/ml顺铂处理0h、48h、72h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况。3.上述三种稳定细胞株细胞经12μg/ml顺铂处理不同时间后,Western blot检测细胞中Bcl-xl、p-p65、p65、p-AKT、AKT、p-ATM、ATM的表达以及PARP裂解情况。4.HepG2细胞瞬时转染不同剂量的RMP过表达和干扰质粒后顺铂处理不同时间,Western blot检测细胞中Bcl-xl、p-IκB、IκB、p-p65、p65、p-AKT、AKT、p-ATM、ATM的表达以及PARP裂解情况。5.上述三种稳定细胞株细胞经12μg/ml顺铂处理48h后,流式细胞术检测线粒体膜电位的变化。6.上述三种稳定细胞株细胞经p65磷酸化抑制剂BAY-11-7082处理后,Western blot检测细胞中p-p65、Bcl-xl的表达情况。7.上述三种稳定细胞株细胞经ATM磷酸化抑制剂KU55933处理后,Western blot检测细胞中p-ATM、p-p65表达情况。8.免疫共沉淀探讨经12μg/ml顺铂处理后,三种稳定细胞株内RMP和p-ATM、PARP及PARP和p-ATM的结合情况。9.免疫组化法检测人肝癌组织及癌旁组织RMP、Bcl-xl、p-ATM、p-p65的表达情况。结果:1.HepG2细胞经不同浓度顺铂(0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml 12μg/ml、16μg/ml)处理48h后,检测细胞凋亡情况显示,随着顺铂浓度的提高,hepg2细胞凋亡率不断增加,最终选择12μg/ml为最佳使用浓度。2.hepg2及过表达rmp(rmpo)、干扰rmp(rmpi)稳定细胞株细胞经12μg/ml的顺铂处理0h、48h、72h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况结果显示,随着顺铂处理时间的延长,各细胞株细胞凋亡率均增加,但过表达rmp的细胞株细胞凋亡率在各时间点均低于hepg2组细胞,干扰rmp细胞株细胞凋亡率在各时间点均高于hepg2组细胞。3.上述三种稳定细胞株细胞经12μg/ml顺铂处理后,westernblot检测蛋白表达情况显示,过表达rmp可以上调bcl-xl的蛋白表达水平、促进p65、atm的磷酸化,抑制parp裂解,但对p65、p-akt、akt、atm的表达不产生影响。干扰rmp有相反的结果。4.hepg2细胞瞬时转染不同剂量的rmp过表达质粒及干扰质粒后,westernblot检测蛋白表达情况结果显示,rmp的表达量与bcl-xl的表达、iκb、p65、atm的磷酸化、parp的裂解水平存在剂量效应,随着rmp表达水平的提高bcl-xl的表达、iκb、p65、atm的磷酸化也逐渐升高,但是parp的裂解却逐渐降低;干扰rmp与上述结果相反。5.流式细胞术检测经12μg/ml顺铂处理后的上述三种稳定细胞株细胞线粒体膜电位情况结果显示,顺铂处理后,各细胞株细胞线粒体膜电位均呈下降趋势,过表达rmp组细胞线粒体膜电位降低幅度明显低于hepg2组细胞,干扰rmp组细胞线粒体膜电位降低幅度明显高于hepg2组细胞。6.上述三种稳定细胞株细胞经p65磷酸化抑制剂bay-11-7082处理后,westernblot检测细胞中p65磷酸化及bcl-xl的表达情况显示,加入抑制剂后p65磷酸化受到抑制同时bcl-xl的表达量也随之降低。7.上述三种稳定细胞株细胞经atm磷酸化抑制剂ku55933处理后,westernblot检测各细胞株中atm、p65磷酸化情况结果显示,加入抑制剂后atm、p65磷酸化水平均降低。8.免疫共沉淀探讨rmp与p-atm及rmp与parp在细胞内的结合情况显示,顺铂处理后rmp可以与parp、p-atm结合,rmp过表达可以促进rmp与parp、p-atm及parp与p-atm的结合。9.免疫组化法检测人肝癌及癌旁组织p-p65、RMP、p-ATM和Bcl-xl的表达情况显示,与癌旁组织相比肝癌组织RMP、Bcl-xl、p-p65表达明显升高。结论:1.RMP具有抑制化疗药物顺铂诱导的细胞凋亡的作用。2.RMP通过促进ATM的磷酸化激活NF-κB通路,进而上调Bcl-xl的表达,抑制细胞凋亡。