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研究目的
缺血性脑卒中是世界范围内常见的死亡和致残原因之一。在病理情况下，突然再灌注可伴有一系列并发症，包括出血性转化、血脑屏障破坏和水肿加重，这会导致进一步的损伤，称为脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion (I/R)injury)。线粒体作为真核生物能量中心，在细胞代谢和生理过程中具有重要的作用。有研究证实，硝化/氧化应激诱导的线粒体损伤是脑缺血-再灌注损伤的重要原因。自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway，ALP)，特别是线粒体自噬途径，是清除损伤线粒体的重要途径之一。电针(electroacupuncture，EA)是一种将传统针灸针刺入腧穴后，在针上通以人体生物电的微量电流波以治疗疾病的一种疗法。本研究着重探讨电针百会和足三里对脑缺血-再灌注损伤大鼠中线粒体、自噬-溶酶体途径以及Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的影响，以期为电针百会和足三里治疗缺血性脑卒中的分子机制提供新的思路和实验依据。
实验方法
按照随机数字表法将85只健康的雄性SD大鼠先进行造模，然后随机分组，本实验分多批次进行。本实验将SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、缺血(I/R)组和电针(EA)组，每组所用大鼠为15只，其余环孢菌素A(CsA)组、ONOO-清除剂(FeTMPyP)组、线粒体分裂抑制剂-1(Mdivi-1)组和Mdivi-1+EA组，每组大鼠10只。采用大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模拟脑缺血-再灌注过程。
第一部分:为验证EA对脑I/R损伤的作用及特异性信号通路，将SD大鼠随机分为3组:Sham组、I/R组和EA组。TTC(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride)染色、GarciaJH评分和尼氏染色分别用于评价脑缺血区、神经功能和神经元损伤。RNA测序(RNA Sequencing，RNA-seq)分析EA的具体调控机制。
第二部分:为了研究EA对脑I/R过程中线粒体功能损伤和损伤线粒体聚集的影响，将SD大鼠随机分为Sham、I/R、EA和CsA四组。检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)和ATP水平，探讨线粒体功能。线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放的有效抑制剂-环孢菌素A(cyclosporine-A，CsA)被用来验证线粒体在大脑I/R过程中的重要作用。此外，检测三种线粒体标志蛋白水平以确定受损线粒体的积累，包括细胞色素C氧化酶Ⅳ(cytochromecoxidaseⅣ，COXⅣ)，线粒体电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)和线粒体外膜转位酶20同系物(translocase of outer mitochondrial membrane 20 homolog, TOMM20)。
为了研究EA对大脑I/R过程中硝化/氧化应激的影响，以及硝化/氧化应激对线粒体功能的影响，将SD大鼠随机分为Sham组、I/R组、EA组和FeTMPyP组。检测了几种关键酶和产物，包括超氧阴离子(superoxide，O2·-)的主要来源-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)oxidase，NOX)，ROS，丙二醛(malondialdehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)以及过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO-)标志物3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)，以确定硝化/氧化应激状态。一种ONOO-清除剂-FeTMPyP被用来研究硝化/氧化应激对线粒体功能的影响。
第三部分:为了研究EA对脑缺血-再灌注期间PI3K/Akt/mTOR介导的自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway，ALP)功能障碍及Pink1/Parkin介导的线粒体自噬清除缺陷的影响，将SD大鼠随机分为Sham、I/R、EA、Mdivi-1和Mdivi-1+EA组。检测ALP各个阶段的关键调控蛋白以及线粒体自噬特异性蛋白，包括磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，哺乳动物雷帕霉素靶蛋(mammalian target of rapamycin complex, mTOR),Sequestosome1(p62/SQSTM1)，Rab7，微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，溶酶体相关2型膜蛋白(lysosome-associated membrane protein type 2，LAMP-2)，动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)，线粒体融合素2基因(mitofusin 2，Mfn2)，磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)诱导的推定激酶蛋白1(phosphatase and tensin homolog (PTEN)-induced putative kinase protein 1,Pink1)，E3泛素连接酶Parkin以确定自噬和线粒体自噬的状态。线粒体自噬的选择性抑制剂Mdivi-1(mitochondrial division inhibitor-1)被用来验证线粒体自噬在脑I/R过程中对神经元损伤的重要作用。
研究结果
1.TTC染色、GarciaJH评分及尼氏染色提示电针百会和足三里可减小I/R大鼠脑梗死面积，改善神经功能及神经元损伤。RNA-Seq实验中GeneOntology(GO)和KEGG通路分析表明脑I/R过程中，电针百会和足三里在受损神经元的生物学过程、细胞成分和分子功能三个方面发挥重要作用，并且其发挥作用与吞噬体(早期自噬前体结构的膜来源)，PI3K/Akt信号通路(关键自噬调节因子)和代谢通路相关。
2.脑缺血-再灌注过程中，下降的MMP和ATP水平提示大脑缺血区域存在线粒体损伤，与此同时，上调的COXⅣ，VDAC和TOMM20蛋白表达提示大脑缺血区域存在受损的线粒体聚集。电针百会和足三里可以逆转上述指标，维持线粒体结构的稳定性，减少受损线粒体的聚集。
脑缺血-再灌注过程中，大脑缺血区域存在硝化/氧化应激水平增高，电针百会和足三里降低了硝化/氧化应激水平，包括降低NOX、ROS、MDA和ONOO-含量，增加SOD活性。与此同时，电针干预和FeTMPyP(一种清除ONOO-的物质)均能增加MMP水平，改善线粒体损伤。
3.脑缺血-再灌注过程中，大脑缺血区域存在自噬的激活，其中包括抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进自噬体的形成和成熟(上调的LC3和Rab7)，以及自噬溶酶体降解的减少(p62/SQSTM1的增加和LAMP-2水平的降低)。电针百会和足三里可以明显改善ALP功能障碍，改善自噬清除。而且，大脑缺血区域存在Pink1/Parkin介导的线粒体自噬不足，包括Drp1、Parkin和Mfn2水平下降。电针百会和足三里增加了Drp1、Parkin和Mfn2水平，促进Parkin和LC3从细胞质向线粒体的转运。此外，Mdivi-1抵消了电针对脑I/R损伤的干预作用。
结论
1.脑缺血-再灌注损伤大鼠脑梗死面积增大，神经功能和神经元损伤。电针百会和足三里可以减小脑I/R大鼠脑梗死面积，改善神经功能和神经元损伤。
2.脑缺血-再灌注损伤大鼠存在神经元的线粒体损伤和损伤线粒体的聚集。电针百会和足三里可以改善脑I/R大鼠神经元的线粒体损伤和损伤线粒体的聚集。
3.脑缺血-再灌注损伤大鼠存在硝化/氧化应激诱导的线粒体损伤。电针百会和足三里可以改善脑I/R大鼠硝化/氧化应激诱导的线粒体损伤。
4.脑缺血-再灌注损伤大鼠存在PI3K/Akt/mTOR诱导的ALP功能障碍和Pink1/Parkin介导的线粒体自噬清除的缺陷。电针百会和足三里通过Pink1/Parkin介导的线粒体自噬途径清除损伤线粒体的聚集，减轻脑缺血-再灌注大鼠神经元损伤。
创新点
本论文在前期工作的基础上，进一步探讨电针百会和足三里穴对脑缺血-再灌注损伤大鼠中线粒体、自噬-溶酶体途径以及Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的影响，验证电针百会和足三里可以抑制硝化/氧化应激改善线粒体损伤，通过PI3K/Akt/mTOR诱导的ALP途径，尤其是Pink1/Parkin介导的线粒体自噬，改善受损线粒体聚集，为电针百会和足三里治疗缺血性脑卒中的分子机制提供新的思路和实验依据。
缺血性脑卒中是世界范围内常见的死亡和致残原因之一。在病理情况下，突然再灌注可伴有一系列并发症，包括出血性转化、血脑屏障破坏和水肿加重，这会导致进一步的损伤，称为脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion (I/R)injury)。线粒体作为真核生物能量中心，在细胞代谢和生理过程中具有重要的作用。有研究证实，硝化/氧化应激诱导的线粒体损伤是脑缺血-再灌注损伤的重要原因。自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway，ALP)，特别是线粒体自噬途径，是清除损伤线粒体的重要途径之一。电针(electroacupuncture，EA)是一种将传统针灸针刺入腧穴后，在针上通以人体生物电的微量电流波以治疗疾病的一种疗法。本研究着重探讨电针百会和足三里对脑缺血-再灌注损伤大鼠中线粒体、自噬-溶酶体途径以及Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的影响，以期为电针百会和足三里治疗缺血性脑卒中的分子机制提供新的思路和实验依据。
实验方法
按照随机数字表法将85只健康的雄性SD大鼠先进行造模，然后随机分组，本实验分多批次进行。本实验将SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、缺血(I/R)组和电针(EA)组，每组所用大鼠为15只，其余环孢菌素A(CsA)组、ONOO-清除剂(FeTMPyP)组、线粒体分裂抑制剂-1(Mdivi-1)组和Mdivi-1+EA组，每组大鼠10只。采用大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模拟脑缺血-再灌注过程。
第一部分:为验证EA对脑I/R损伤的作用及特异性信号通路，将SD大鼠随机分为3组:Sham组、I/R组和EA组。TTC(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride)染色、GarciaJH评分和尼氏染色分别用于评价脑缺血区、神经功能和神经元损伤。RNA测序(RNA Sequencing，RNA-seq)分析EA的具体调控机制。
第二部分:为了研究EA对脑I/R过程中线粒体功能损伤和损伤线粒体聚集的影响，将SD大鼠随机分为Sham、I/R、EA和CsA四组。检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)和ATP水平，探讨线粒体功能。线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放的有效抑制剂-环孢菌素A(cyclosporine-A，CsA)被用来验证线粒体在大脑I/R过程中的重要作用。此外，检测三种线粒体标志蛋白水平以确定受损线粒体的积累，包括细胞色素C氧化酶Ⅳ(cytochromecoxidaseⅣ，COXⅣ)，线粒体电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)和线粒体外膜转位酶20同系物(translocase of outer mitochondrial membrane 20 homolog, TOMM20)。
为了研究EA对大脑I/R过程中硝化/氧化应激的影响，以及硝化/氧化应激对线粒体功能的影响，将SD大鼠随机分为Sham组、I/R组、EA组和FeTMPyP组。检测了几种关键酶和产物，包括超氧阴离子(superoxide，O2·-)的主要来源-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)oxidase，NOX)，ROS，丙二醛(malondialdehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)以及过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO-)标志物3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)，以确定硝化/氧化应激状态。一种ONOO-清除剂-FeTMPyP被用来研究硝化/氧化应激对线粒体功能的影响。
第三部分:为了研究EA对脑缺血-再灌注期间PI3K/Akt/mTOR介导的自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway，ALP)功能障碍及Pink1/Parkin介导的线粒体自噬清除缺陷的影响，将SD大鼠随机分为Sham、I/R、EA、Mdivi-1和Mdivi-1+EA组。检测ALP各个阶段的关键调控蛋白以及线粒体自噬特异性蛋白，包括磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，哺乳动物雷帕霉素靶蛋(mammalian target of rapamycin complex, mTOR),Sequestosome1(p62/SQSTM1)，Rab7，微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，溶酶体相关2型膜蛋白(lysosome-associated membrane protein type 2，LAMP-2)，动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)，线粒体融合素2基因(mitofusin 2，Mfn2)，磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)诱导的推定激酶蛋白1(phosphatase and tensin homolog (PTEN)-induced putative kinase protein 1,Pink1)，E3泛素连接酶Parkin以确定自噬和线粒体自噬的状态。线粒体自噬的选择性抑制剂Mdivi-1(mitochondrial division inhibitor-1)被用来验证线粒体自噬在脑I/R过程中对神经元损伤的重要作用。
研究结果
1.TTC染色、GarciaJH评分及尼氏染色提示电针百会和足三里可减小I/R大鼠脑梗死面积，改善神经功能及神经元损伤。RNA-Seq实验中GeneOntology(GO)和KEGG通路分析表明脑I/R过程中，电针百会和足三里在受损神经元的生物学过程、细胞成分和分子功能三个方面发挥重要作用，并且其发挥作用与吞噬体(早期自噬前体结构的膜来源)，PI3K/Akt信号通路(关键自噬调节因子)和代谢通路相关。
2.脑缺血-再灌注过程中，下降的MMP和ATP水平提示大脑缺血区域存在线粒体损伤，与此同时，上调的COXⅣ，VDAC和TOMM20蛋白表达提示大脑缺血区域存在受损的线粒体聚集。电针百会和足三里可以逆转上述指标，维持线粒体结构的稳定性，减少受损线粒体的聚集。
脑缺血-再灌注过程中，大脑缺血区域存在硝化/氧化应激水平增高，电针百会和足三里降低了硝化/氧化应激水平，包括降低NOX、ROS、MDA和ONOO-含量，增加SOD活性。与此同时，电针干预和FeTMPyP(一种清除ONOO-的物质)均能增加MMP水平，改善线粒体损伤。
3.脑缺血-再灌注过程中，大脑缺血区域存在自噬的激活，其中包括抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进自噬体的形成和成熟(上调的LC3和Rab7)，以及自噬溶酶体降解的减少(p62/SQSTM1的增加和LAMP-2水平的降低)。电针百会和足三里可以明显改善ALP功能障碍，改善自噬清除。而且，大脑缺血区域存在Pink1/Parkin介导的线粒体自噬不足，包括Drp1、Parkin和Mfn2水平下降。电针百会和足三里增加了Drp1、Parkin和Mfn2水平，促进Parkin和LC3从细胞质向线粒体的转运。此外，Mdivi-1抵消了电针对脑I/R损伤的干预作用。
结论
1.脑缺血-再灌注损伤大鼠脑梗死面积增大，神经功能和神经元损伤。电针百会和足三里可以减小脑I/R大鼠脑梗死面积，改善神经功能和神经元损伤。
2.脑缺血-再灌注损伤大鼠存在神经元的线粒体损伤和损伤线粒体的聚集。电针百会和足三里可以改善脑I/R大鼠神经元的线粒体损伤和损伤线粒体的聚集。
3.脑缺血-再灌注损伤大鼠存在硝化/氧化应激诱导的线粒体损伤。电针百会和足三里可以改善脑I/R大鼠硝化/氧化应激诱导的线粒体损伤。
4.脑缺血-再灌注损伤大鼠存在PI3K/Akt/mTOR诱导的ALP功能障碍和Pink1/Parkin介导的线粒体自噬清除的缺陷。电针百会和足三里通过Pink1/Parkin介导的线粒体自噬途径清除损伤线粒体的聚集，减轻脑缺血-再灌注大鼠神经元损伤。
创新点
本论文在前期工作的基础上，进一步探讨电针百会和足三里穴对脑缺血-再灌注损伤大鼠中线粒体、自噬-溶酶体途径以及Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的影响，验证电针百会和足三里可以抑制硝化/氧化应激改善线粒体损伤，通过PI3K/Akt/mTOR诱导的ALP途径，尤其是Pink1/Parkin介导的线粒体自噬，改善受损线粒体聚集，为电针百会和足三里治疗缺血性脑卒中的分子机制提供新的思路和实验依据。