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目的：本文以急性心肌缺血(Acute Myocardial Ischemia，AMI)大鼠为研究对象，以针刺联合骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BM-MSCs)静脉移植为干预手段，旨在探讨针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况，并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。
材料与方法：
1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记：健康雄性SD大鼠3只(SPF级，4周龄，体重150-160g)，采用7%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，浸泡于75%酒精消毒5min，无菌条件下取胫骨、股骨，PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液，离心后接种于培养瓶，放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养，及时更换培养基，待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶2传代培养，显微镜观察细胞形态变化，取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记(CD29、CD73、CD90、CD44、CD45)，并取第三代细胞BrdU标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。
2.AMI大鼠模型的制备：60只健康雄性SD大鼠，腹腔注射7%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉，通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型，将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组，每组10只；同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎，随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。
3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠：造模结束后1小时，干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs(2×106个/ml)，同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴，刺入皮下深度2-3mm，疏密波，频率2Hz，强度2mA左右，以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度，留针30min，24h治疗一次，共治疗10次；其他各组不针刺，但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声，随即处死各组大鼠，取腹主动脉全血，分离出血清备用；同时快速取出心脏，生理盐水冲洗干净，每组随机挑选1个心脏样本，在缺血区域切薄片5片，用于大鼠心肌缺血面积的测定，其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况，并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。
(1)针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究
观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化，分析BM-MSCs的鉴定和标记结果，采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析，采用氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。
(2)针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究
苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况；蛋白质印迹法(Western Blot，WB)技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量；酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。
结果：
1.与假手术组比较，模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高(P＜0.01)，而LVEF、LVFS明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低(P＜0.01)，而LVEF、LVFS明显升高(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异(P＞0.05)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低(P＜0.01)，而LVEF、LVFS明显升高(P＜0.01)。
2.假手术组大鼠未见心肌缺血；与假手术组比较，模型组大鼠心肌缺血面积明显升高(P＜0.01)，缺血区面积占左心室总面积的18.39%；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化，针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低(P＜0.01)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组(P＜0.01)。
3.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低(P＜0.01或P＜0.05)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低(P＜0.01)。
4.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化(P＞0.05)，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高(P＜0.01)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高(P＜0.01)。
5.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低(P＜0.01)；针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组(P＜0.01)。
6.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化(P＞0.05)，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高(P＜0.01)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高(P＜0.01)。
7.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P＜0.01)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P＜0.01)。
结论：
1.针刺联合BM-MSCs移植能够显著改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化，降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积，提高AMI大鼠心脏功能，为临床治疗本病提供了新思路。
2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达，降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平，以及上调抑炎因子IL-10水平，减轻AMI后过度表达的炎症反应，从而减轻心肌细胞坏死；通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达，从而减少AMI后心肌细胞凋亡；通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达，诱导内皮细胞形成，从而改善心肌供血。
材料与方法：
1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记：健康雄性SD大鼠3只(SPF级，4周龄，体重150-160g)，采用7%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，浸泡于75%酒精消毒5min，无菌条件下取胫骨、股骨，PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液，离心后接种于培养瓶，放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养，及时更换培养基，待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶2传代培养，显微镜观察细胞形态变化，取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记(CD29、CD73、CD90、CD44、CD45)，并取第三代细胞BrdU标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。
2.AMI大鼠模型的制备：60只健康雄性SD大鼠，腹腔注射7%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉，通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型，将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组，每组10只；同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎，随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。
3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠：造模结束后1小时，干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs(2×106个/ml)，同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴，刺入皮下深度2-3mm，疏密波，频率2Hz，强度2mA左右，以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度，留针30min，24h治疗一次，共治疗10次；其他各组不针刺，但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声，随即处死各组大鼠，取腹主动脉全血，分离出血清备用；同时快速取出心脏，生理盐水冲洗干净，每组随机挑选1个心脏样本，在缺血区域切薄片5片，用于大鼠心肌缺血面积的测定，其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况，并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。
(1)针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究
观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化，分析BM-MSCs的鉴定和标记结果，采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析，采用氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。
(2)针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究
苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况；蛋白质印迹法(Western Blot，WB)技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量；酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。
结果：
1.与假手术组比较，模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高(P＜0.01)，而LVEF、LVFS明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低(P＜0.01)，而LVEF、LVFS明显升高(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异(P＞0.05)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低(P＜0.01)，而LVEF、LVFS明显升高(P＜0.01)。
2.假手术组大鼠未见心肌缺血；与假手术组比较，模型组大鼠心肌缺血面积明显升高(P＜0.01)，缺血区面积占左心室总面积的18.39%；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化，针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低(P＜0.01)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组(P＜0.01)。
3.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低(P＜0.01或P＜0.05)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低(P＜0.01)。
4.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化(P＞0.05)，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高(P＜0.01)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高(P＜0.01)。
5.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低(P＜0.01)；针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组(P＜0.01)。
6.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化(P＞0.05)，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高(P＜0.01)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高(P＜0.01)。
7.与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P＜0.01)；与干细胞组比较，针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P＜0.01)；与针刺组比较，针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高(P＜0.01)。
结论：
1.针刺联合BM-MSCs移植能够显著改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化，降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积，提高AMI大鼠心脏功能，为临床治疗本病提供了新思路。
2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达，降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平，以及上调抑炎因子IL-10水平，减轻AMI后过度表达的炎症反应，从而减轻心肌细胞坏死；通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达，从而减少AMI后心肌细胞凋亡；通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达，诱导内皮细胞形成，从而改善心肌供血。