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结核病(TB)是威胁人类健康的重要传染病。2018年全球结核病报告显示2017年全球范围内估算有1000万结核病新发病例,约有160万例患者死亡;与此同时,耐药结核病仍然是严重危害公共健康的疾病,2017年全球估算新发利福平耐药结核病(Resistant to Rifampicin,RR-TB)患者55.8万例(48.3-63.9万),其中82%为耐多药结核病(Multidrug-Resistant TB,MDR-TB)。而在MDR-TB患者中,估算8.5%为广泛耐药结核病(Extensivelydrug-resistant TB,XDR-TB)。因此,了解结核分枝杆菌的耐药机制,寻找参与耐药的相关基因,进而开发抗结核病新药物对于提高耐多药/广泛耐药结核病的治疗效果显得尤为重要。而目前,对于结核分枝杆菌生物学等基础研究的发展较为缓慢,一方面是结核分枝杆菌代时较长,约为24小时;另一方面受限于缺乏有效的遗传操作系统构建基因敲除突变株和点突变株,获得一个完全突变株的时间大概需要至少半年以上,这严重制约了对于结核分枝杆菌生物学研究。虽然现已有许多基因操作工具成功应用于分枝杆菌中,但都存在着容易使细菌生长受限、构建过程繁琐耗时长以及重组效率低等诸多缺点。CRISPR-Cas系统,包括CRISPR-Cas9系统和CRISPR-Cas12a(Cpf1)系统,具有精确识别及剪切特异性DNA序列的功能而被开发成一种高效便捷的基因编辑工具。在应用中,CRISPR系统可在特定靶点形成DNA双链断裂,继而诱导同源重组(HR)或非同源末端连接修复(NHEJ),为基因组定向改造与调控带来了革命性的突破。本论文旨在以CRISPR-Cas系统为基础开发适用于结核分枝杆菌的基因组编辑工具。论文第一部分将CRISPR-Cas系统,尤其是CRISPR-Cas12a系统与同源重组系统配合使用,即在重组的过程中,构建靶向crRNA引导Cas12a核酸酶对靶点进行剪切产生双链断裂,则可对未发生重组的进行淘汰,从而筛选出发生重组的突变体。首先验证了 CRISPR-Cas12a在耻垢分枝杆菌中具有剪切活性;然后结合同源重组,验证了利用单链DNA寡核苷酸可以有效地进行点突变、删除及插入,随后证实可以双链DNA进行无标签的删除与替换。综上所述CRISPR-Cas系统辅助的同源重组技术在耻垢分枝杆菌中能够快速高效地进行多种基因无标签和无痕突变。本论文的第二部分用CRISPR-Cas系统联合NHEJ,实现了在结核分枝杆菌中进行一步法删除基因。首先将第一部分CRISPR-Cas系统辅助的同源重组技术运用到了海分枝杆菌中,结果并没有发生预期的同源重组而是发生了非同源末端连接的修复。为了进一步推广该系统在其他分枝杆菌中的应用,我们通过三个步骤来增加NHEJ的活性:1)高表达NHEJ元件增加NHEJ修复效率;2)抑制RecA介导的HR,进而增加NHEJ修复效率;3)通过诱导启动表达使CRISPR-Cas介导的DSB断裂发生在菌体生长的稳定期。我们构建了一系列的基因组编辑系统,其中耻垢分枝杆菌需要两步,结核分枝杆菌需要三步才能实现高效的CRISPR-Cas介导的NHEJ进行基因组编辑。与此同时,我们还利用该系统在结核分枝杆菌中实现了精确删除以及同时引入多重突变,实现对结核分枝杆菌基因的高效、快速的遗传操作。此外,鉴于该系统的高效性,可以将该系统用于构建突变子库进行高通量筛选,为深入研究结核分枝杆菌基因的功能,进而了解结核分枝杆菌耐药相关机制提供可靠的技术支持。