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研究背景和目的糖尿病肾病（DKD）越来越普遍,证据显示,在DKD在发展过程中,肾小管发挥了重要作用。小管间质纤维化就是DKD病程中肾小管最常见的病理变化之一。DKD最早可检测到的临床表现是微量白蛋白尿,而研究发现白蛋白是促进肾小管上皮细胞间质纤维化的一个关键因素。因此,在DKD的发展过程中,积极探讨白蛋白导致肾小管上皮细胞损伤的病理生理机制具有重要意义。细胞周期阻滞是细胞衰老的重要的特征之一。研究表明,损伤后的肾小管上皮细胞阻滞在G2/M期,进而导致促纤维化因子生成增多,促进了肾纤维化。因此,通过延缓细胞衰老可能成为遏制DKD,改善肾纤维化的潜在重要方法之一。目前除了肾素-血管紧张素系统阻滞剂以外,近几年新开发的降糖药钠-葡萄糖协同转运体（Sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2）抑制剂成为肾脏保护的新药物。有研究发现通过抑制SGLT2表达后可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞衰老标志物的表达,但机制仍不明确。因此,我们通过在体外利用白蛋白（BSA）干预肾小管上皮细胞（HK-2）模拟蛋白尿的微环境,研究白蛋白是否可以诱导肾小管上皮细胞早衰,及其可能的机制是否与白蛋白导致肾小管间质纤维化相关;进一步探索SGLT2抑制剂达格列净是否通过改善肾小管上皮细胞衰老而延缓细胞间质纤维化,进而发挥肾脏保护作用。方法1、以近端肾小管上皮细胞（HK-2）为研究对象,用含不同浓度的白蛋白培养HK-2细胞72小时,模拟体内蛋白尿的微环境。先在光学显微镜下观察细胞形态、密度改变,然后通过β-半乳糖苷酶染色后,在显微镜下观察β-半乳糖苷酶活性的改变;接着,通过免疫荧光染色来观察细胞核膜的完整性,通过RT-PCR来检测laminB1和衰老相关分泌表型（SASP）成分IL-1α、IL-6和IL-8 mRNA的表达情况,通过Western blot观察DNA损伤标志γ-H2AX的表达;2、用含不同浓度的白蛋白培养HK-2细胞72小时,利用特异性抗体p-PH3Ser10,通过免疫荧光染色的方法来观察细胞是否发生G2/M期阻滞,通过RT-PCR和Western blot观察促纤维化因子的mRNA和蛋白的表达情况;Western blot进一步检测与G2/M期进程相关蛋白p21、CDK1和CDC25C的表达水平;3、用含白蛋白培养HK-2细胞72小时的同时,利用si-p21敲低HK-2细胞中的p21的表达,再次通过免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot来观察和检测HK-2细胞G2/M期进程情况、促纤维化因子的mRNA和蛋白的表达水平,进一步通过Western blot检测CDK1和CDC25C的磷酸化水平;4、用不同浓度的达格列净联合白蛋白培养HK-2细胞72小时,通过免疫荧光染色的方法来观察不同浓度的达格列净对细胞G2/M期进程的影响,Western blot检测G2/M期进程相关蛋白p21、CDK1、CDC25C和促纤维化因子的蛋白表达情况,以此来了解不同浓度达格列净对细胞的影响。结果1、白蛋白诱导肾小管上皮细胞早衰不同浓度BSA处理HK-2细胞72 h后,随着白蛋白浓度的增加,细胞密度下降,以BSA（20mg/ml）组最为明显,经典的衰老试验（SA-β-Gal染色）显示,与对照组相比,BSA诱导了更高水平的SA-β-gal活性。同时,20mg/ml BSA可促进HK-2细胞中衰老相关分泌表型（SASP）IL-1α、IL-8、IL-6显著表达。另外,我们观察到,BSA（20mg/ml）干预72 h后,HK-2细胞核膜中laminB1的表达明显减少,而Western blot结果显示DNA双链断裂标志物γ-H2AX的表达增加了 1.5倍。上述结果表明白蛋白可以诱导肾小管上皮细胞衰老。2、肾小管上皮细胞（HK-2）出现间质纤维化与白蛋白诱导细胞在G2/M期进程受阻相关我们通过细胞免疫荧光染色检测发现p-H3（+）的HK-2细胞随着BSA浓度的增加而逐渐增加,说明白蛋白诱导的HK-2细胞衰老的确发生了G2/M 期阻滞;Western blot 结果显示,20mg/ml BSA 处理组 CTGF 和α-SMA表达增加。这些数据表明BSA具有诱导HK-2细胞产生促纤维化因子的能力。与对照组相比,BSA（20 mg/ml）组p21 mRNA和蛋白表达分别提高59%和3.2倍。我们再通过siRNA-p21转染降低p21的表达,发现BSA联合转染siRNA-p21的HK-2细胞中p-H3（+）细胞明显减少;与此同时,western blot结果显示,转染siRNA-p21后,BSA组HK-2细胞的CTGF和α-SMA的表达明显降低。CDC25C和CDK1磷酸化水平的升高是细胞周期阻滞在G2/M期的标志。我们的研究表明,随着BSA浓度的增加,CDC25C和CDK1的磷酸化水平明显增加。然后,我们使用siRNA-p21转染经20mg/ml BSA处理的HK-2细胞,结果显示其CDK1和CDC25C磷酸化水平降低。3、达格列净通过抑制肾小管上皮细胞G2/M期阻滞改善细胞间质纤维化我们用不同浓度的达格列净联合BSA干预HK-2细胞,结果显示达格列净可以减少肾小管上皮细胞TGF-β1和CTGF的表达,同时细胞免疫荧光染色的结果也显示其可以改善肾小管上皮细胞G2/M期阻滞;进一步我们通过Western blot检测发现,通过不同浓度的达格列净的干预,HK-2细胞的p21的表达均受到不同程度的抑制,并且CDK1和CDC25C磷酸化水平也出现了显著的降低。结论白蛋白诱导肾小管上皮细胞发生衰老,衰老的肾小管上皮细胞细胞发生了 G2/M期阻滞,导致了促纤维化因子升高;而通过抑制p21的表达可减少肾小管上皮细胞细胞G2/M期阻滞,进而减少肾小管上皮细胞促纤维化因子的产生;达格列净通过抑制p21的表达,改变CDK1和CDC25C的磷酸化水平,使细胞周期进程受到影响,减少阻滞在G2/M期的细胞,从而减少了促纤维化因子的生成,发挥了抗纤维化的作用。