论文部分内容阅读
多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)是一种特异性结合RNA和DNA Poly(C)片段的蛋白,具有维持mRNA稳定和调节翻译的功能;同时,PCBP2通过E3泛素连接酶AIP4泛素化降解VISA,负调控VISA介导的信号转导通路,抑制IFNs的产生。有研究表明,PCBP2能促进口蹄疫病毒(FMDV)的复制,但是具体机制尚不清楚,因此探明其机制将对口蹄疫的防控提供重要的科学依据。1.用带有Flag标签的FMDV蛋白VP2、2B、3A、L、VP0、2C、3C、3D质粒分别与HA-PCBP2质粒共转染HEK293T细胞,通过免疫共沉淀和GST pull-down检测能与PCBP2发生互作的FMDV蛋白。结果显示,FMDV结构蛋白VP0、VP2、2B、2C和3D可与PCBP2相互作用。2.用Myc-PCBP2质粒、IFN-β-Luc/ISRE-Luc报告质粒、和PRL-TK内参质粒共同转染HEK293T细胞,双荧光素酶报告系统检测。结果表明,PCBP2抑制SeV诱导的细胞信号通路,并对VISA介导的细胞信号通路有负调控作用,且呈剂量依赖性。用FMDV蛋白L、VP2、2C、3D、VP0、2B质粒分别与Myc-PCBP2、IFN-β-Luc报告质粒、PRL-TK内参质粒及HA-VISA质粒共同转染HEK293T细胞,双荧光素酶报告系统检测。结果显示,FMDV蛋白2C、3D、VP0和2B能够进一步增强PCBP2对VISA介导的信号通路的负调控作用。3.用FMDV蛋白2C、3D、VP0和2B质粒分别与PCBP2质粒共转染细胞,Western blot检测。结果表明,FMDV蛋白VP0和PCBP2共转染能促进VISA的降解。进一步试验证实:PCBP2通过蛋白酶体途径降解VISA,FMDV蛋白VP0通过凋亡途径降解VISA,FMDV蛋白VP0和PCBP2通过凋亡途径共同降解VISA;且FMDV蛋白VP0能促PCBP2-VISA复合物的形成,但对PCBP2-AIP4复合物没有影响。用FMDV感染野生型MEF细胞和VISA敲除的MEF细胞,实时荧光定量PCR检测FMDV的mRNA水平。结果显示,VISA敲除的细胞中FMDV的mRNA水平明显增高。本研究首次证实,PCBP2与FMDV蛋白VP0的相互作用,促进PCBP2特异性降解接头蛋白VISA,抑制IFN-β的产生,使FMDV逃避天然免疫而在细胞内复制。