论文部分内容阅读
天然免疫是机体抵抗病毒入侵的第一道防线,其核心是宿主细胞通过模式识别受体侦测入侵的病毒从而产生干扰素(IFN)、促炎因子和趋化因子等限制病毒感染。干扰素在天然免疫中发挥着重要作用,先前的研究表明感染猪圆环病毒2型(PCV2)的仔猪血浆中含有低水平的干扰素,但关于干扰素是通过何种机制产生,到目前为止未见报道。宿主细胞可通过产生干扰素抑制病毒感染,而病毒在长期进化过程中也形成了一系列拮抗干扰素生成的机制,以往研究显示PCV2可以抑制浆样树突状细胞(pDC)分泌IFN-α,但对于PCV2抑制干扰素产生的机制还不清楚。鉴于此,有必要弄清PCV2感染过程中对干扰素生成的调控机制。因此,本实验以PK-15细胞为模型,研究PCV2感染PK-15细胞后IFN-β表达以及相关的信号通路,并在此基础上进一步研究PCV2对IFN-β生成的抑制作用和机制,以期更好的深入了解PCV2的致病机制,同时为PCV2的防治提供理论基础.1 PCV2诱导PK-15细胞生成IFN-β的信号通路研究为了研究PCV2感染后PK-15细胞中干扰素的变化及其相关的信号通路,本实验将PK-15细胞感染PCV2,于感染后Oh、3h、12h、24h、48h、72h收集细胞。用荧光定量PCR检测IFN-β的mRNA含量,结果显示PCV2感染后PK-15细胞中IFN-β的mRNA含量在48 h、72 h显著升高(P<0.01);IFN-β主要经NF-κB或IRF3/7信号途径生成,本实验中分别用TBK1/IKKε抑制剂(BX795)和NF-κB抑制剂(BAY 11-7082)处理PK-15细胞,结果显示NF-κB抑制剂组的IFN-β的mRNA含量与PCV2组相比无显明显变化,TBK1/IKKε抑制剂组的IFN-β的mRNA含量与PCV2组相比显著降低(P<0.01),上述结果表明PCV2可以通过IRF3信号通路诱导PK-15细胞生成IFN-β;为了确定IRF3信号途径中的信号分子是否被激活,检测了模式识别受体(RIG-1、MDA-5、DAI)、接头蛋白(MAVS、Sting)和干扰素调节因子(IRF3、IRF7)的 mRNA 含量以及 RIG-1、MDA-5、DAI、IRF3、p-IRF3、IRF7 的蛋白含量,结果显示DAI、RIG-1、MDA-5的mRNA含量和蛋白含量在72h显著升高(P<0.01),接头蛋白 MAVS、Sting 的 mRNA含量在 48 h显著升高(P<0.01),p-IRF3、IRF7的蛋白含量在72h显著升高(P<0.01),IRF3的蛋白含量没有变化。以上结果表明PCV2感染PK-15细胞后可被DNA模式识别受体DAI和RNA模式识别受体RIG-1和MDA-5识别,进而激活IRF3诱导IFN-β产生。2 PCV2抑制poly(I:C)诱导PK-15细胞生成IFN-β的机制初探为了探讨PCV2能否抑制干扰素的产生,本实验将PK-15细胞感染PCV2后,用干扰素诱导剂poly(I:C)作用于PK-15细胞,通过荧光定量PCR方法检测IFN-β、模式识别受体(RIG-1和MDA-5)和抗病毒蛋白(Mx1、OAS、ISG15)的mRNA表达,Western检测RIG-1、p-IRF3蛋白变化。试验结果显示:PCV2抑制了 poly(I:C)诱导PK-15细胞生成干扰素的能力;下调了 poly(I:C)作用于PK-15细胞后的RIG-1、Mx1、OAS和ISG15的mRNA表达,而MDA-5 mRNA含量未见变化;而且PCV2还降低了 poly(I:C)作用于PK-15细胞后的RIG-1和p-IRF3蛋白含量。以上结果表明,PCV2感染后可通过RIG-1/IRF3信号通路抑制IFN-β生成。