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研究目的1.探索外周血环状RNA在冠状动脉钙化患者中的差异表达及其诊断价值研究;2.探索环状RNA:mmu-Pex13-0003、mmu-Galk2-0007在小鼠动脉钙化形成中的表达。研究方法1.高通量微阵列芯片分析三组钙化与非钙化组人血管平滑肌细胞circRNAs差异表达谱;2.由于本研究的主要目的是筛选可作为冠状动脉钙化（CAC）诊断的生物标志物,所以我们将注意力集中在钙化组表达上调的circRNAs,从钙化组中挑选出表达明显上调的circRNAs作为候选circRNAs;3.进一步在CAC患者血浆进行验证高通量circRNAs基因芯片的数据处理结果,我们通过qRT-PCR技术检测来自于31例冠状动脉钙化（CACs>100）患者和40例冠状动脉非钙化（CACs=0）对照者血浆的候选circRNAs的表达水平（相对表达）,同时分析血浆差异表达circRNAs与冠状动脉钙化评分之间的相关性;4.采用受试者工作特征曲线（ROC）评价血浆差异表达circRNAs对冠状动脉钙化的诊断效能;5.主动脉血管钙化小鼠模型的建立,8周龄C57BL/6小鼠普通饲料适应性喂养2周,实验组小鼠应用尼古丁 25mg/kg溶于花生油中搅拌混匀后对小鼠进行灌胃,九小时后相同剂量尼古丁复灌胃处理,维生素D3（300000IU/kg）溶于无水乙醇后左侧后肢股部肌肉注射,同时给予高脂饲料饮食建立小鼠血管钙化模型;正常对照组小鼠同等剂量花生油灌胃,九小时后相同剂量花生油复灌胃处理,无水乙醇左侧后肢股部肌肉注射,同时给予普通饲料饮食;自由饮水、饮食,环境温度控制在22-25℃、湿度<60%,自然采光,分笼饲养。分别于第0、2、4、6周诱导小鼠血管钙化处理,于第8周处理各组小鼠,取出小鼠主动脉组织,应用Von Kossa染色观察各组间小鼠主动脉弓处血管钙化情况;应用免疫组织化学方法检测BMP2、BMP4、RUNX2等钙化标志蛋白在小鼠主动脉组织的表达;应用Western blot方法检测BMP2、BMP4等钙化标志蛋白在小鼠主动脉组织表达情况;6.依据血浆验证的冠状动脉钙化差异表达circRNAs结果,然后设计出小鼠同源circRNAs的引物序列,应用qRT-PCR测定各组小鼠主动脉circRNAs表达水平（相对表达量）。研究结果1.高通量微阵列芯片分析三组钙化与非钙化组人血管平滑肌细胞circRNAs差异表达谱结果显示,钙化组的人的血管平滑肌细胞组和非钙化组间相比有46个差异表达的circRNAs,其中在钙化组中表达上调的有15个circRNAs,下调的有31个 circRNAs;2.我们进一步从钙化组中表达上调的15个circRNAs挑选出表达明显上调的circRNAs 作为候选 circRNAs,包括 hsa-circ-0008534、hsa-circ-0002622、hsa-circ-0008488、hsa-circ-0001478、hsa-circ-0019225;3.经多次重复试验结果显示,hsa-circ-0008534、hsa-circ-0002622、hsa-circ-0008488在冠状动脉钙化组与对照组患者血浆表达水平（相对表达）差异有统计学意义;然而,在血浆水平未检测到hsa-circ-0001478、hsa-circ-0019225的存在。进一步行 Spearman 相关性分析 hsa-circ-0008534、hsa-circ-0002622、hsa-circ-0008488与CAC患者冠状动脉钙化评分（CACs）的相关性结果显示,hsa-circ-0008534 与 CACs 存在正相关（r=0.557;p=0.001）;hsa-circ-0008488 与 CACs之间存在正相关（r=0.487;p=0.005）;hsa-circ-0002622与冠状动脉钙化严重程度无线性相关性（r=0.271;p=0.140）;4.受试者工作特征曲线（ROC曲线）显示,血浆hsa-circ-0008534、hsa-circ-0002622、hsa-circ-0008488相对表达水平对CAC的诊断效能分别为（AUC:0.790;95%CI:0.676-0.905;p<0.001）、（AUC:0.733;95%CI:0.614-0.831;p=0.001）、（AUC:0.801;95%CI:0.689-0.886;p<0.001）。5.C57BL/6小鼠自模型建立开始,实验组小鼠体重逐渐下降,两周后体重逐渐回升;Von Kossa钙盐沉积染色显示,自诱导小鼠主动脉血管钙化处理8周后,主动脉弓处血管环出现明显钙化;小鼠主动脉弓处血管环免疫组化及Western blot结果显示,模型建立处理8周后BMP2、BMP4等钙化标志蛋白明显增多;以上实验结果均证明,C57BL/6小鼠血管钙化模型建立成功;6.依据人鼠基因同源性,找出与人类hsa-circ-0008534、hsa-circ-0008488同源的小鼠的circRNAs分别为mmu-Pex13-0003、mmu-Galk2-0007,设计出其引物序列;应用qRT-PCR测定各组小鼠主动脉mmu-Pex13-0003、mmu-Galk2-0007表达水平（相对表达量）结果显示,在小鼠诱导血管钙化处理8周后其主动脉组织mmu-Pex13-0003相对表达量高于对照组（p=0.002）、mmu-Galk2-0007相对表达量高于对照组（p=0.023）。研究结论1.血浆 hsa-circ-0008534、hsa-circ-0002622、hsa-circ-0008488 相对表达量是很好的冠状动脉钙化诊断标志物,且血浆hsa-circ-0008534、hsa-circ-0008488相对表达量能够很好地预测CAC患者冠状动脉钙化严重程度;2.尼古丁灌胃、维生素D3肌肉注射联合高脂饮食诱导C57BL/6小鼠血管钙化是很好的研究血管钙化的动物模型;3.钙化的小鼠主动脉组织中mmu-Pex13-0003、mmu-Galk2-0007相对表达量高于对照组,mmu-Pex13-0003、mmu-Galk2-0007参与了血管钙化的进展。