【摘 要】
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目的:瞬时外向钾电流（Ito）在维持细胞膜电位和调节细胞兴奋性中起重要作用,Ito的异常是众多心肌兴奋性相关疾病的电生理基础。Kv4.2是啮齿类动物心肌Ito通道的核心α亚基,KChIP2是Kv4.2的关键调节亚基。目前已知KChIP2和通道在脂筏中的定位与交感兴奋所引起的Kv4.2的磷酸化均能影响Kv4.2在细胞膜上的稳定性,三者密切相关,但相互关联的分子机制却不明确,本课题旨在研究这其中作用分
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目的:瞬时外向钾电流（Ito）在维持细胞膜电位和调节细胞兴奋性中起重要作用,Ito的异常是众多心肌兴奋性相关疾病的电生理基础。Kv4.2是啮齿类动物心肌Ito通道的核心α亚基,KChIP2是Kv4.2的关键调节亚基。目前已知KChIP2和通道在脂筏中的定位与交感兴奋所引起的Kv4.2的磷酸化均能影响Kv4.2在细胞膜上的稳定性,三者密切相关,但相互关联的分子机制却不明确,本课题旨在研究这其中作用分子机制,从而进一步揭示机体内调控Kv4.2功能活性的分子机制,为心肌兴奋性相关疾病提供新的认知视野和治疗思路。方法:通过构建带荧光标记的Kv4.2、KChIP2和脂筏标记物（GPI）的表达质粒,首先在异源表达体系中应用共定位技术分析Ito亚基与脂筏之间的定位关系;进一步通过药物刺激以及点突变模拟Kv4.2不同的磷酸化状态,研究Kv4.2-S552位点磷酸化对其在细胞膜上定位分布的影响;采用免疫共沉淀和荧光共振能量转移（FRET）技术明确Kv4.2磷酸化对Kv4.2与KChIP2相互作用的影响;应用膜片钳的技术手段比较Kv4.2野生型与磷酸化突变体在电生理特性的差异;通过外源插入HA标签标记细胞膜上Kv4.2,比较Kv4.2野生型和磷酸化突变体在细胞膜上稳定性的差异;通过提取细胞膜脂筏组分和膜质分离在乳鼠心肌细胞中研究交感刺激对Kv4.2在脂筏中定位的影响,以及在膜上稳定性的影响。结果:（1）在异源表达系统中,Kv4.2与KChIP2呈现出不同的脂筏定位分布,KChIP2能够帮助Kv4.2定位到脂筏微结构域;（2）PKA激动剂Forskolin处理后Kv4.2与脂筏共定位程度降低,与之相符的,模拟磷酸化状态的突变体Kv4.2-S552D与脂筏共定位程度与野生型相比也降低;（3）Forskolin处理后,Kv4.2与KChIP2的相互作用明显减弱,并且Kv4.2-S552D与野生型和非磷酸化状态的突变体相比,Kv4.2-S552D与KChIP2的相互作用也显著减弱;（4）发现Kv4.2-S552D突变体与野生型和非磷酸化状态的突变体相比,其所组成的Ito通道电流幅值降低并且激活曲线右移;（5）比较野生型和突变型Kv4.2在细胞膜上的稳定性,发现与脂筏共定位程度最低的突变体Kv4.2-S552D在膜上的荧光强度降低最快,表明其在细胞膜上驻留的稳定性最差;（6）在原代乳鼠心肌细胞中交感刺激可以引起Kv4.2在脂筏/非脂筏间的分布比例降低,从而伴随着在细胞膜/细胞质间分布比例也是降低的。结论:（1）Kv4.2自身不能定位到脂筏,与KChIP2相互作用可以帮助Kv4.2定位到细胞膜的脂筏区域;（2）Kv4.2-S552位点被磷酸化后,Kv4.2与KChIP2相互作用减弱,从而引起Kv4.2迁出脂筏区域;（3）不论是在异源表达系统还是在原代心肌细胞中,Kv4.2在脂筏中定位分布降低伴随着其在细胞膜上的稳定性降低,从而影响Ito的功能的发挥。
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