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全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)是一种含有8个碳原子的全氟化合物。由于PFOA具有很好的耐热性和化学稳定性,以及疏水疏油等特征,被广泛应用于纺织、造纸和制造皮革等表面防污处理剂。PFOA可通过消化道、呼吸道和皮肤途径进入人体,因此几乎所有人群体内都可以检测到PFOA的存在。流行病学资料显示,育龄女性血清中PFOA浓度和月经周期异常、经血量过少的发病呈正相关。本研究室已报道了卵巢早衰患者血中的PFOA浓度明显高于正常健康对照人群。但是相关的分子机制迄今仍然不明确。下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)生殖-内分泌轴参与调控雌性的动情周期和卵巢功能。下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,Gn RH)能够促进腺垂体释放黄体生成素(luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH),使卵巢雌激素(estradiol,E2)合成增加,进而促进卵泡发育和排卵。在下丘脑前腹侧室旁核(anteroventral periventricular nucleus,AVPV),E2可增强kiss肽神经元的活性,促进Gn RH表达和释放,诱导LH涌动和促发排卵。但在弓状核(arcuate nucleus,ARC),E2可抑制kiss肽神经元活性。视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)血管升压素(vasopressin,AVP)神经元也调节AVPV-kiss肽神经元的活性,在排卵过程中起关键作用。有研究已证明,PFOA是过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)的激动剂。肝细胞的PPARα活化可以增加成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)的合成与释放。FGF21释放入血后可以透过血脑屏障进入脑,抑制SCN-AVP表达。因此,本研究提出PFOA通过增加肝脏PPARα介导FGF21的合成与释放,抑制SCN-AVP神经元,从而影响生殖-内分泌系统导致动情周期和卵巢功能异常的设想。研究目的1.阐明PFOA暴露对雌性小鼠动情周期和卵巢功能的影响。2.探讨PFOA改变生殖-内分泌系统,影响动情周期和卵巢功能的调控机制。实验方法1.动物模型的制备:12周龄雌性ICR小鼠进行连续28天PFOA(0.5,2,5 mg/kg)灌胃处理,分别简称为PFOA(0.5)小鼠、PFOA(2)小鼠和PFOA(5)小鼠。2.给药方法:(1)PPARα阻断剂GW6471(GW)腹腔注射(i.p.)剂量为1 mg/kg[1]。(2)FGF21受体抑制剂PD173074(PD)侧脑室注射(i.c.v.)剂量为25μg/鼠[2],血管升压素vasopressin(AVP)给药剂量为3 ng/鼠[3],GPR54激动剂kisspeptin-10给药剂量为1 nmol/鼠[4]。3.在PFOA处理期间,用阴道涂片方法检测小鼠的动情周期。4.组织学检查:(1)用4%多聚甲醛浸泡固定卵巢和肝脏组织,脱水后石蜡包埋,连续切片(5μm)后进行苏木素-伊红(HE)染色。对HE染色后的卵巢组织切片进行各级卵泡和黄体计数。(2)用4%多聚甲醛进行心脏灌流,取脑进行冰冻切片(30μm),kiss肽抗体进行免疫染色。5.用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清LH、E2、孕酮(P4),肝脏和下丘脑FGF21,下丘脑Gn RH浓度。6.用实时定量逆转转录聚合酶链反应(RT-q PCR)的方法检查FGF21、Kiss1和AVP的m RNA水平。7.用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测肝脏FGF21的蛋白水平。8.用高效液相色谱/串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测血浆PFOA的含量。9.采用t检验(正态分布数据)对两个组的数据进行分析,三组及三组以上采用重复测量方差分析、单因素方差分析和双因素方差分析(ANOVA)并进行Bonferroni事后检验或Dunnet事后检验来分析平均值之间的差异。实验结果1.与对照组小鼠相比,PFOA(0.5)小鼠和PFOA(2)小鼠的体重没有显著改变,但是PFOA(5)小鼠于PFOA处理的第24天出现体重下降。PFOA(5)小鼠的肝脏重量显著增加,肝细胞肿大且肝小叶排列不规则,而PFOA(0.5)小鼠和PFOA(2)小鼠的肝脏重量及肝脏组织学形态均无显著异常。这些结果提示,PFOA(5 mg/kg)暴露引起小鼠的体重降低和肝脏毒性。2.与对照组小鼠相比,PFOA(2)小鼠和PFOA(5)小鼠的动情间期显著延长,而动情前期和动情期的时间并没有明显改变。PFOA(2)小鼠和PFOA(5)小鼠的卵巢黄体数目显著减少,但是窦状卵泡的数量并没有明显改变。这些结果提示,PFOA(2-5 mg/kg)暴露引起雌鼠发生动情间期延长和排卵障碍。3.PFOA(2)小鼠和PFOA(5)小鼠的血清生殖激素Gn RH,LH和P4水平明显低于对照组小鼠。对照组小鼠和PFOA(0.5)小鼠在动情前期可以出现LH涌动,但是PFOA(2)小鼠和PFOA(5)小鼠几乎没有产生LH涌动。在卵巢摘除(OVX)的对照组小鼠,使用高剂量EB处理可以诱导LH涌动。在OVX-PFOA(5)小鼠,EB不能诱导LH涌动。这些结果提示,PFOA(2-5 mg/kg)暴露抑制HPG内分泌轴活性和LH涌动产生。4.与对照组小鼠相比,PFOA(2)小鼠和PFOA(5)小鼠AVPV-kiss肽阳性细胞和AVPV-kiss1的m RNA水平均显著降低,但是没有改变ARC-kiss肽阳性细胞和ARC-kiss1的m RNA水平。EB能增加OVX对照组小鼠的AVPV-kiss肽阳性细胞,AVPV-kiss1的m RNA水平,而不增加OVX-PFOA(2)小鼠的AVPV-kiss肽表达。但是用PFOA直接处理下丘脑的脑片不影响AVPV-kiss1的m RNA水平。这些结果提示,PFOA(2-5 mg/kg)经口给药能抑制AVPV-kiss肽的表达。5.与对照组小鼠相比,PFOA(2)小鼠和PFOA(5)小鼠肝脏FGF21的m RNA和FGF21蛋白水平、血清和下丘脑的FGF21浓度均明显增高。PPARα阻断剂GW6471能阻止PFOA(2)小鼠肝脏FGF21的m RNA,血清和下丘脑的FGF21水平增加。这些结果提示,PFOA(2-5 mg/kg)通过肝脏细胞PPARα活化能促进FGF21的表达。大量FGF21的释放导致下丘脑的FGF21浓度增加。6.与对照组小鼠相比,PFOA(2)小鼠和PFOA(5)小鼠SCN-AVP的m RNA水平明显降低。PPARα阻断剂GW6471或者FGF21受体抑制剂PD173074处理能纠正PFOA(2)小鼠SCN-AVP,AVPV-kiss1的m RNA水平降低。血管升压素给药也能恢复PFOA(2)小鼠AVPV-kiss1的m RNA水平。此外,GW6471,PD173074,血管升压素AVP或GPR54激动剂kisspeptin-10处理能恢复PFOA(2)小鼠的生殖激素Gn RH,LH和P4水平。这些结果提示,PFOA(2mg/kg)暴露通过促进下丘脑FGF21水平升高能抑制SCN-AVP神经细胞活性,导致kiss肽-HPG轴活性降低。7.GW6471,PD173074,血管升压素AVP或GPR54激动剂kisspeptin-10处理能恢复PFOA(2)小鼠的动情间期,卵巢黄体数目,LH涌动产生。这些结果提示,PFOA(2 mg/kg)暴露通过抑制kiss肽-HPG轴活性引起动情周期和卵巢功能异常。结论1.PFOA(≥2 mg/kg)暴露成年雌性小鼠引起动情间期延长和排卵障碍。2.PFOA通过活化肝脏细胞PPARα受体促进FGF21合成。3.FGF21通过血脑屏障抑制SCN-AVP神经元活性,导致AVPV-kiss肽活性降低。4.AVPV-kiss肽和HPG生殖-内分泌系统活性降低导致动情间期延长和排卵障碍。