目的:通过研究青蒿琥酯对甲状腺癌细胞的影响,建立裸鼠移植瘤模型,在体外和体内探讨青蒿琥酯对甲状腺癌的抗癌作用,并探究其作用机制,拟为甲状腺癌患者预测淋巴结转移和预后评估提供新的可靠依据,并为肿瘤转移调控模式提供新的思路和完善依据,为开发新型治疗策略提供理论依据。方法:1.体外实验（1）青蒿琥酯对甲状腺癌细胞增殖的影响。用20μM、40μM、80μM的青蒿琥酯处理甲状腺癌BHT101和TPC1细胞24h,同时设立阴性对照组。通过CCK-8实验检测ART对BHT101和TPC1细胞增殖活力的影响。通过Ed U（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）实验和克隆形成实验进一步检测ART对BHT101和TPC1细胞增殖的影响。通过流式细胞术检测ART对BHT101和TPC1细胞周期和细胞凋亡的影响。通过Western-blot实验检测ART对BHT101和TPC1细胞迁移相关蛋白E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达的影响。通过划痕实验检测ART对BHT101和TPC1细胞迁移能力的影响。通过Transwell实验检测ART对BHT101和TPC1细胞侵袭能力的影响。（2）青蒿琥酯对甲状腺癌细胞作用机制的研究。对青蒿琥酯处理的细胞及对照组细胞进行m RNA转录组二代测序,每组做三个平行。通过生物信息学对基因表达进行分析,筛选差异基因并富集基因,进行通路富集分析,同时进行GSEA分析。通过网络药理学分析进行分子对接寻找ART作用靶蛋白。2.体内实验（1）4周龄的雌性BABL/c裸鼠,适应性喂养1周,将TPC1细胞（2×10~7）皮下注射到裸鼠中,建立甲状腺癌异种移植裸鼠。将小鼠随机分为对照组和给药组,给药组小鼠进行灌胃给药,对照组小鼠给予生理盐水灌胃,一周后观察成瘤情况。每两天监测一次小鼠的肿瘤生长,5周后断颈处死裸鼠,在小鼠死亡后解剖取材,称重并进行后续实验。（2）肿瘤组织行免疫组化Ki-67染色和Tunel染色,确定肿瘤细胞增殖指数和凋亡率。提取肿瘤组织的蛋白,利用Western-blot检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白bax、bcl-2、RAPR的蛋白表达水平。同时通过Western-blot检测肿瘤组织中E2F1相关蛋白E2F1、c-Myc、Cyclin E的表达水平。结果:1.体外实验（1）加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞的OD值均降低,且青蒿琥酯剂量依赖性降低BHT101和TPC1细胞的OD值,青蒿琥酯剂量依赖性降低BHT101和TPC1细胞的细胞活力。加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞克隆集落数均减少,其中,低浓度（20μM）青蒿琥酯明显减少克隆集落数（P＜0.05）,中浓度（40μM）和高浓度（80μM）对克隆集落数形成的抑制能力更强（P＜0.001）,表明青蒿琥酯具有降低BHT101和TPC1细胞的增殖的能力。Ed U实验结果显示青蒿琥酯作用后Ki-67阳性数量减少,随着青蒿琥酯浓度的增加,Ki-67阳性细胞数量呈递减趋势。统计结果显示,青蒿琥酯抑制BHT101和TPC1细胞的增殖能力,且呈剂量依赖性。划痕实验结果显示,青蒿琥酯孵育BHT101和TPC1细胞24小时后,与对照组相比,划痕面积增加,且随着青蒿琥酯浓度增加划痕面积逐渐增加,表明青蒿琥酯降低BHT101和TPC1细胞的迁移能力。Transwell结果显示,青蒿琥酯孵育BHT101和TPC1细胞24小时后,与对照组相比,通过Transwell小室的细胞数量减少,呈剂量依赖性。结果显示ART降低BHT101和TPC1细胞的侵袭能力。此外,进一步通过Western-blot检测迁移相关蛋白的表达,从蛋白水平检测青蒿琥酯对甲状腺癌细胞迁移的影响。结果显示,与对照组相比,随着青蒿琥酯浓度的增加,BHT101和TPC1细胞中E-钙粘蛋白表达增加,同时,波形蛋白和N-钙粘蛋白表达下降。进一步统计分析显示青蒿琥酯剂量依赖性地增加E-钙粘蛋白表达,抑制波形蛋白和N-钙粘蛋白表达（P＜0.05）。通过流式细胞术分析可以看出,与对照组相比,加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞凋亡的比率增加（P＜0.01）,呈剂量依赖性。为了进一步确定ART诱导甲状腺癌细胞BHT101和TPC1细胞凋亡,通过Western-blot检测凋亡相关蛋白的表达,从蛋白水平检测ART对甲状腺癌细胞凋亡的影响。与对照组相比,随着青蒿琥酯浓度的增加,BHT101和TPC1细胞中PARP和Bax蛋白表达均增加,同时,Bcl-2蛋白表达减少,进一步统计分析发现青蒿琥酯剂量依赖性地增加PARP和Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达（P＜0.05）。碘化丙啶（propidium lodide,PI）染料可以特异性地与DNA结合,通过流式细胞仪检测荧光强度,从而反映细胞周期的分布。分析结果显示,与对照组相比,加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞G1期细胞数量均增多,S期细胞数量均减少,G2期细胞数量无明显变化。（2）通过对m RNA转录组测序分析发现,青蒿琥酯处理的甲状腺癌细胞与对照组细胞具有3052个显著性差异基因,其中上调基因1086个,下调基因1966个。功能富集分析显示这些基因显著富集于E2F1通路。GSEA分析显示E2F1通路被抑制。青蒿琥酯的3D结构与关键靶蛋白E2F1对应的蛋白结构导入Auto Dock软件进行分子对接,两者之间有良好的结合活性。（3）为了进一步确定青蒿琥酯抗甲状腺癌的分子机制,我们检测了青蒿琥酯对BHT101和TPC1甲状腺癌细胞E2F1信号通路的影响。用20μM、40μM、80μM的青蒿琥酯处理BHT101和TPC1细胞24小时,提取蛋白进行Western-blot。与对照组相比,青蒿琥酯处理后E2F1、c-Myc、cyclin E蛋白表达降低,具有显著性差异,统计分析结果显示具有剂量依赖性。提取RNA检测E2F1信号通路相关基因的m RNA的表达水平。结果与蛋白质检测结果相对应,青蒿琥酯处理BHT101和TPC1甲状腺癌细胞后,E2F1通路相关蛋白E2F1、c-Myc、cyclin E基因表达水平降低,与对照组相比具有显著性差异,呈剂量依赖性,结果表明青蒿琥酯抑制甲状腺癌BHT101和TPC1细胞E2F1信号通路。为了进一步验证青蒿琥酯通过抑制E2F1信号通路发挥作用,我们对BHT101和TPC1细胞进行了E2F1过表达。首先通过CCK-8检测E2F1过表达后,青蒿琥酯对E2F1过表达BHT101和TPC1细胞的作用:与对照组相比,BHT101和TPC1细胞给药组OD值降低;E2F1过表达组OD值与给药组相比OD值升高。Ed U实验结果显示,与对照组相比,青蒿琥酯作用后Ed U阳性细胞数量明显减少;与Vector组相比,E2F1过表达组Ed U阳性细胞明显增加。克隆形成实验评估E2F1过表达后,青蒿琥酯对E2F1过表达BHT101和TPC1细胞的增殖的作用:给药组BHT101和TPC1细胞集落数减少,与对照组相比有显著差异;E2F1过表达组BHT101和TPC1细胞,与对照组相比,细胞集落数没有明显差异,与Vector组相比,细胞集落数明显增加。流式细胞术检测E2F1过表达后,青蒿琥酯对E2F1过表达BHT101和TPC1细胞的凋亡的作用:给药组BHT101和TPC1细胞凋亡细胞增加,与对照组相比有显著差异;给药+E2F1过表达组BHT101和TPC1细胞,与Vector组相比细胞凋亡数量明显减少。Transwell检测E2F1过表达后,青蒿琥酯对E2F1过表达BHT101和TPC1细胞的侵袭的作用:给药组BHT101和TPC1细胞侵袭细胞减少,与对照组相比有显著差异;给药+E2F1过表达组BHT101和TPC1细胞,青蒿琥酯处理后细胞侵袭数量增加,与Vector组相比细胞侵袭数量明显增加。2.体内实验 青蒿琥酯给药异种移植裸鼠20天后,青蒿琥酯给药组裸鼠肿瘤体积变小,重量减轻,与对照组相比具有显著性差异。青蒿琥酯给药后,肿瘤组织免疫组化Ki-67检测和Tunel染色结果显示,与对照组相比,给药组肿瘤组织Ki-67阳性细胞明显减少,Tunel标记的凋亡细胞明显增多。同时,检测肿瘤组织中凋亡蛋白的表达情况,与对照组相比,青蒿琥酯给药后,Bax和RARP蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少。青蒿琥酯给药后,检测肿瘤组织中E2F1信号通路表达情况。与对照组相比,青蒿琥酯给药后,E2F1、c-Myc、Cylin E蛋白表达减少,统计分析具有显著性差异。结论:青蒿琥酯抑制BHT101和TPC1细胞增殖,降低BHT101和TPC1细胞迁移和侵袭能力,促进BHT101和TPC1细胞凋亡,并将BHT101和TPC1细胞阻滞于G0/G1期。青蒿琥酯通过与E2F1结合抑制E2F1通路,从而抑制BHT101和TPC1细胞活力、增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,将细胞阻滞于G0/G1期,并抑制甲状腺癌异种移植裸鼠的肿瘤生长。