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自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）是一种异质性神经发育障碍性疾病,其主要临床特征包括语言沟通障碍、社会交往障碍以及限制性和重复性刻板行为,常伴有认知障碍及精神发育迟滞等。ASD的发病率呈逐年上升的趋势,但到目前为止,ASD仍然没有明确的致病原因,也没有有效的治疗手段,已经成为儿童精神类致残的最主要疾病之一,正在并将持续给家庭和社会带来沉重的经济负担。研究表明,ASD是由遗传基因和围产期外部环境因素暴露共同作用的结果。因此,深入研究与ASD密切相关的风险因素,尤其是环境危害因素在ASD发生发展过程中的作用,进而从风险因素源头采取积极的病因预防措施,对于ASD防治具有极其重要的意义。在过去的十多年里,越来越多的证据表明,围产期的空气污染暴露能增加ASD的患病风险,有众多学者提出“空气污染可能是ASD发生发展的重要环境危害因素”这一假说。然而相关的研究多局限于流行病学调查,关于空气污染暴露导致ASD的实验室证据还相当缺乏,对其致病机制的研究也还非常有限。因此,有必要在实验室水平开展相关研究,探讨空气污染与ASD相关性,为上述医学假设提供动物研究证据支持,为进一步认识其致病机制和预防措施研究提供理论依据。目的1.本研究拟以新生SD大鼠作为受试对象,以细颗粒物(fine particular matter,PM2.5)作为暴露源,建立出生早期空气污染暴露动物模型,观察PM2.5暴露能否导致幼鼠出现ASD样行为改变,研究空气污染致ASD的病理生理学特点,为证实空气污染暴露是ASD发生发展的重要危险因素提供证据。2.检测PM2.5暴露对幼鼠神经炎症和ASD易感基因的影响,揭示PM2.5暴露对幼鼠神经发育损害的结构与功能基础,初步探索空气污染暴露导致动物ASD样行为的可能机制。方法1.在建立空气污染暴露的动物模型之前,采集天津市中心城区采暖期典型空气污染物PM2.5,洗脱冻干后配制成悬液,以备动物染毒暴露。并对采样期间的PM2.5质量浓度进行监测,对采集到的PM2.5进行了有害成分检测,共检测16种多环芳烃和9种重金属元素。在模型建立时,选择了8日龄SD大鼠,暴露组给予每公斤体重2 mg和20 mg两个不同剂量的PM2.5悬液鼻腔滴注,溶剂对照组滴注生理盐水,空白对照不做处理,每天滴注一次,共染毒2周,建立出生早期PM2.5暴露大鼠模型。2.为研究出生早期PM2.5暴露与儿童ASD的关系,在上述动物模型基础上,运用超声发声分析实验评估幼鼠的交流能力;三箱社交实验与嗅觉习惯化/去习惯化实验评估幼鼠的社交能力;埋珠实验评估幼鼠的重复刻板行为;旷场实验评估幼鼠的自主行为;新物体识别实验评估幼鼠的学习记忆能力,观察暴露幼鼠是否出现ASD样行为学变化。3.为观察PM2.5暴露对幼鼠神经炎症和ASD易感基因的影响,运用ELISA法检测幼鼠海马及前额皮层中促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,运用RT-q PCR法检测幼鼠海马中星形胶质细胞和小胶质细胞的标志物Gfap、Iba1,ASD易感基因Cntnap2、Shank3、Nrxn1、Mecp2、Fmr1的m RNA表达水平。并运用Western blot法对差异表达的基因在蛋白水平加以验证。4.为进一步验证神经元突触发育障碍在PM2.5所致大鼠ASD样行为改变中起到的作用,运用Nissl染色法观察PM2.5对大鼠海马神经元组织形态的影响;运用透射电镜法观察大鼠海马神经元突触结构数量的变化,并用免疫荧光法检测突触素的表达水平。结果1.对PM2.5的监测结果表明,在采样期间,PM2.5质量浓度均值为187.2μg/m3,达到重度污染的水平。PM2.5成分检测结果显示多环芳烃总浓度达到1.61μg/m3,重金属元素总浓度达到3.882μg/m3。2.超声发声分析结果表明高剂量暴露组幼鼠超声发声次数显著下降,提示高剂量PM2.5暴露降低了幼鼠交流能力;三箱社交实验结果显示高剂量组幼鼠与陌生鼠接触时间显著减少;嗅觉习惯化/去习惯化实验结果显示高剂量暴露组幼鼠对社交气味的嗅探行为显著少于其他组,与三箱社交实验结果一起提示高剂量PM2.5暴露减弱了幼鼠的社交能力;埋珠实验结果表明PM2.5暴露组幼鼠埋珠数量均显著低于对照组;新物体识别实验结果发现PM2.5暴露组幼鼠探索新物体时间显著少于对照组与埋珠实验一起,提示PM2.5暴露使幼鼠探索新事物兴趣减弱。综上所述,PM2.5鼻腔滴注暴露导致幼鼠出现了交流能力下降、社交能力减弱以及害怕陌生事物等典型ASD样行为改变。3.ELISA检测结果表明,PM2.5暴露造成海马和皮层中IL-1β、IL-6、TNF-α表达上调,PM2.5的暴露促使幼鼠海马中Gfap、Iba1的m RNA表达水平显著升高,ASD易感基因Shank3的m RNA水平显著降低。此外,用western blotting方法对上述结果加以验证,发现GFAP和IBA1在蛋白质水平同样显著升高,而SHANK3蛋白表达水平也显著降低。上述结果提示PM2.5暴露加剧了幼鼠神经系统的炎性反应,造成了ASD易感基因的表达异常。4.对突触的研究结果显示,高剂量PM2.5暴露组幼鼠海马CA1、CA3区锥体细胞层数增多,神经元数量增加,高剂量PM2.5暴露组突触数量较其他两组明显增多,PM2.5暴露上调了大鼠CA3区突触素蛋白的表达。结论综上所述,出生早期PM2.5暴露导致幼鼠出现交流能力下降、社交能力减弱以及害怕陌生事物等一系列典型ASD样行为改变;PM2.5暴露引起的中枢神经系统的炎性反应加剧,以及神经突触过度形成,加之ASD易感基因Shank3的表达异常,共同突触功能障碍,进而导致神经连接紊乱,可能是PM2.5所致ASD样行为改变的潜在机制。