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高温胁迫(heat shock)严重威胁家蚕(Bombyx mori)生长和发育,高温胁迫能够造成细胞氧化损伤。还原型谷胱甘肽是细胞内合成的一种能够抵御氧化胁迫的三肽。中肠作为家蚕主要的消化器官,负责将桑叶中蔗糖消化分解成葡萄糖和果糖,并加以吸收供自身代谢使用和进一步转运到血淋巴供其它器官使用。本研究对5龄2d家蚕幼虫进行高温胁迫(35C)和禁食(以排除热冲击对家蚕食下量的可能影响)双重处理,连续处理24h后,恢复到25C正常饲喂。在处理期和恢复期每隔8h取肠液、中肠和血液,利用苏木精-伊红染色法、分光光度法和荧光定量PCR法分别检测组织损伤、谷胱甘肽代谢及关键酶基因表达和葡萄糖代谢的影响,以调查热冲击对家蚕中肠结构和功能的影响。主要获得如下结果: 1.高温胁迫造成家蚕中肠组织损伤 高温胁迫会引起5龄家蚕幼虫中肠细胞形态的损伤,24h长时间处理会引起中肠细胞严重空泡化,最终导致5龄家蚕幼虫中肠组织的损伤。 2.高温胁迫促使中肠谷胱甘肽氧化还原循环增强 实验组中肠细胞还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值始终低于对照组,表明高温胁迫引起中肠氧化损伤。实验组中肠GSH含量显著低于对照组,而氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性和谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性都显著高于对照组,表明以GSH为还原底物的清除ROS的反应增强。与此同时,谷胱甘肽还原酶(GR)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性也显著增强,表明为了保证GSH供应,还原GSSG生成GSH的反应也增强。可见,高温胁迫导致中肠细胞谷胱甘肽氧化还原循环加强。 3.高温胁迫对谷胱甘肽氧化还原系统关键酶基因的表达产生明显影响 对谷胱甘肽氧化还原系统关键酶 TrxR、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)进行基因克隆分析,并对基因表达水平的定量 PCR检测发现,TrxR、GCL、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)这三个酶基因转录水平与酶活变化情况基本一致。表明高温胁迫在基因转录层面对家蚕谷胱甘肽氧化还原系统酶活性造成影响。 4.高温胁迫导致家蚕对糖的消耗量增加、中肠消化吸收能力下降 肠液、中肠和血淋巴中葡萄糖等含量变化与蔗糖降解以及葡萄糖吸收转运水平有关。由实验可得:高温胁迫引起处理期实验组中肠糖原和血液中的海藻糖、糖原含量显著低于对照组,说明高温胁迫导致家蚕消耗糖的量增加。在恢复期实验组肠液蔗糖、果糖、葡萄糖含量都显著高于对照组,而肠液蔗糖酶含量显著低于对照组,由此表明高温胁迫导致中肠吸收能力下降。 上述结果表明,高温胁迫在基因转录水平诱导谷胱甘肽氧化还原循环加强,导致氧化胁迫,造成组织损伤;组织损伤引起家蚕中肠糖类物质消化、吸收功能下降。