研究目的帕金森病又称震颤麻痹,是中老年人常见的中枢神经系统椎体外系退行性疾病。主要的病理特征是黑质致密部大量多巴胺能神经元的坏死,纹状体内多巴胺含量减少。临床以静止性震颤、肌强直、姿势异常和运动迟缓以及平衡功能障碍为主要表现,可伴有记忆力减退、抑郁等精神障碍。帕金森病与年龄、遗传、环境等因素相关,发病率有逐年增加并有年轻化的趋势。近年来,农药(如百草枯)在饮水、食品中的残留被认为是帕金森病的重要诱发因素。有研究报道,国内外农民以及除草剂(如百草枯)暴露人群中帕金森病的发病率会相对增加。百草枯被广泛应用于农业生产。其结构与经典帕金森病造模剂1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)及其活性代谢产物MPP+极为相似,具有与MPTP相似的神经毒性作用。百草枯可通过皮肤接触或吸入、经服食沾有该除草剂的食物、饮用水进入人体内。国外已经报道百草枯的暴露是帕金森病的一个重要致病因素。国内外常通过腹腔或脑内注射或皮下注射百草枯建立小鼠、大鼠帕金森病模型,这与人类的主要经口暴露方式相差甚远。通过大鼠口服百草枯建立PD模型的研究尚未见报道。因此,本研究通过口服途径使大鼠较长时间暴露于百草枯,模拟人类接触该除草剂方式建立大鼠的PD模型,为大鼠PD模型制作提供新的方法,为PD发病机制及其防治研究提供实用的模型动物。研究方法1 实验分组大鼠随机分为4组,分别为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组16只,每天分别按生理盐水,5mg/kg百草枯,10mg/kg百草枯和20mg/kg百草枯给药,连续灌胃4个月,监测大鼠实验前后体重变化情况。2行为学检测(1) 日常行为观察主要观察动物精神状况,行为动作,给药前后有无异常表现等。(2)旷场实验4个月后,每组随机抽取8只大鼠进行试验,把大鼠分别放入100cm×100cm×45cm的旷场箱内,通过动物旷场实验视频分析系统采集分析大鼠在5min内的运动总路程和中央活动时间。(3)水迷宫实验定位航行实验：本实验总历4天,4次/天,每次从4个不同象限分别将大鼠靠着正对池壁放入池中,分别记录动物从进水到找到并爬上平台的时间,也就是动物的逃避潜伏期。如果大鼠在90s内没找到平台那就将其引向平台,逃避潜伏期记为90s。大鼠找到并爬上平台后,让其停歇15 s,然后再进行下一次实验。当天的成绩以4次/天的算术平均值记。空间探索实验：在第5天撤除平台,在第1象限将大鼠面对池壁投入水中,视频分析系统记录其在水中2 min内的游泳路径及穿过原平台的次数。(4)强迫游泳实验每组随机抽取8只大鼠进行试验,将大鼠放入内径20cm,高40cm的玻璃圆缸中,缸中水深24cm,水温25℃。实验第一天,每只大鼠预游15min,24h后进行测试,将大鼠放入缸中,视频分析系统记录其5 min内的绝对不动时间。3各组大鼠肝肾功能的检测 实验结束时三组大鼠中每组随机抽取8只,用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后通过眼眶静脉丛采取血液1.5ml,分离血清,测定ATLBUN、Cr。4病理学观察将每组随机抽取6只大鼠,采集肺、中脑组织并用10%甲醛固定后制作石蜡切片,进行HE染色。观察各组大鼠肺、中脑黑质部组织病理学变化。5 HPLC-FD法检测多巴胺及其代谢产物含量(1)色谱条件采用Waters-510泵；Nucleosil-C18(4mm×250mm)色谱柱；流动相：20Ommol/L柠檬酸三钠缓冲液(用盐酸调节pH为3.5)：甲醇：乙腈=85：10：5,经0.451μm的滤膜真空抽滤；脱气,流速1.0ml/min柱温：室温。荧光检测器波长设置为：激发波长280nm,发射波长315nm；以峰面积定量。(2)标准品和样品的制备与测定标准品制备：DA、HVA、5-HT分别溶解于O.1mol/L HCl04中,浓度为0.5g/L,贮存于-20℃冰箱中；分析时将上述溶液稀释成20μg/L作为标准溶液。样品制备：每组大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后快速断头取脑,在预冷的0.1mol/L PBS缓冲液中剥离出纹状体,经干冰固化称重后迅速-80℃冰冻保存。测定时取出标本置于匀浆器中,加入lml预冷的HCl04,制成匀浆。于台式冷冻离心机中15000g离心20min,取上清液0.22μm滤器过滤进样检测。根据外标法进行定量,计算出样本中各项指标的浓度,并表示为n g/mg组织(湿重)。6统计学分析 实验数据采用SPSS13.0进行分析,组间比较为Independent sample t检验,实验数据均用x±s表示,P<0.05则具有统计学差异。结果1 日常行为观察给药一周后,与对照组相比,发现给药的两组部分大鼠出现拉稀和鼻孔出血；两周后中剂量组大鼠会出现呼吸急促,甚至出现嚎叫的现象、喂药后竖毛、翘尾和异常活泼,随时间推移,以上症状逐渐减轻；四周后,中剂量组大鼠呆滞、反应迟钝；十周后,中剂量组部分大鼠动作僵硬,且维持到实验结束；而低剂量组大鼠整个过程没有明显上述变化。另外,高剂量组大鼠在实验过程出现大量死亡,4个月后所剩大鼠数量无统计意义,因此,在进行检测时把高剂量组剔除2 大鼠体重的变化 由统计结果显示,造模前各组大鼠体重比较无差异(P>0.05),造模后各组大鼠体重都有明显的增加,但组间差异不显著,不具有统计学意义(P>0.05)。3 旷场实验 由结果显示,对照组大鼠5min内中央活动时间是中剂量组的13.69倍,差异显著(P=0.043),低剂量组的中央活动时间与对照组相比差异不显著(P=0.248)。各组大鼠5min内运动总路程分别为(2610.41±633.55)cnl,(2556.90±837.97)cm,(2507.69±780.07)cm,虽然对照组>低剂量组>中剂量组,但经统计结果表明,各组间均无统计学差异(P>0.05)。4水迷宫实验定位航行实验：在连续的4d的训练中,中剂量组和低剂量组与对照组相比,每天平均逃避潜伏期均增加,但是只有中剂量组与对照组比较(P值分别为0.010,0.028,0.036,0.021)差异有统计学意义(P<0.05)；而低剂量组与对照组比较(P值分别为0.049,0.024,0.085,0.091),两组差异无统计学意义。空间探索实验：统计结果表明,中剂量组大鼠穿越平台次数(2.14-0.69)与对照组(3.86±0.69)相比明显减少,差异极显著(P<0.01),但是低剂量组(3.14±1.57)与对照组相比差异不显著(P=0.291)。5 肝肾功能检测 采血后测定BUN,Cr以及ALT指标。各组之间的肾功能(BUN、Cr)无明显差异(P>0.05),而中剂量组的ALT虽然比低剂量组和对照组有所增高,但均不具有统计学差异(P>0.05)。6病理学观察6.1 中脑病理观察 由结果显示对照组大鼠大致正常,中剂量组大鼠黑质神经元细胞大量萎缩,色素大量减少,胶质细胞增生,低剂量组大鼠有轻度上述变化。6.2肺组织病理观察 由结果显示中剂量组大鼠肺泡腔严重淤血,肺泡上皮坏死脱落,肺泡间质中炎细胞浸润,低剂量组大鼠肺组织损伤程度较轻,而对照组大鼠正常。7纹状体中神经递质含量通过HPLC检测测定结果显示,中剂量组大鼠4个月后纹状体中的DA及HVA含量较对照组均明显下降,分别下降20.0%(P<0.01)和11.3%(P<0.01)。而低剂量组大鼠纹状体中的DA和HVA含量较对照组也有下降,但差异不显著(P分别为0.108和0.197)。5-HT检测结果显示,两个实验组与对照组相比不具统计学差异(P>0.05)。结论综上所述,百草枯是导致PD的主要环境因素之一。SD大鼠通过口服方式暴露于百草枯可以发生典型的PD样改变,行为学方面出现日常活动减少,学习记忆能力下降等；形态学方面大鼠中脑黑质致密部DA能神经细胞减少明显；生化方面大鼠纹状体中DA及其代谢物HVA降低明显等等。大鼠肺泡腔严重淤血,肺泡上皮坏死脱落,肺泡间质中炎细胞浸润,这表明口服百草枯会对肺组织产生毒副作用,该毒性作用可能也是高剂量组的高死亡率原因。另外,虽然肝脏和肾脏是百草枯的主要代谢器官,但检测结果显示本研究方法尚未损伤动物肝肾功能。这些结果提示了,通过亚慢性暴露于百草枯可导致大脑黑质DA能神经系统产生明显的变化,说明口服百草枯建立PD模型是有效可行的,这为大鼠制作PD模型提供了新的方法。