目的:首先制备壳聚糖纳米粒,并且给予PEG表面修饰,分析其相关物理学、生物学特性,以期获得一种缓释的非病毒载体介导系统,其次行培养的大鼠血管内皮细胞转染,观察其转染效率,细胞毒性等,并从分子蛋白水平观察对ACE基因的下调作用,最后以筛选出的合适剂量转染自发性高血压大鼠,观察降压疗效以及对靶器官的影响等生物效应。方法:1载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒制备以及生物学特性1 )应用本实验室前期实验中筛选出的能显著下调ACE基因的靶序列:5’—AACCTAACATGTCAGCCTCTG—3’(基因序列位点3603-3624),由武汉晶赛公司协助合成质粒,采用菌液用碱裂解法大量抽提和纯化重组质粒,随机酶切测序,并检测质粒浓度与纯度。2)采用离子交联法制备壳聚糖纳米粒, PEG修饰壳聚糖纳米粒,复凝聚法制备不同PH值、体积比以及PEG化的载ACEshRNA壳聚糖纳米。喷金电镜下对各种壳聚糖纳米粒悬液扫描并照相,观察纳米粒与形态。同时使用zeta电位仪测定其颗粒大小、zeta电位值和多分散度。应用凝胶阻滞分析验证载ACEshRNA壳聚糖纳米多聚复合物的形成及电荷性质。紫外分光光度计检测离心后上清液中DNA的含量,计算包埋率,绘制PEG-CS/DNA纳米复合物累积释放曲线,以及分析纳米粒对核酸酶的抗性。2.载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒对血管内皮细胞转染条件的筛选1)组织贴块法体外培养大鼠血管内皮细胞,免疫荧光法检测胞浆Ⅷ因子进行鉴定,台盼兰染色检测细胞成活率。2)分别以较佳配比率(纳米粒:质粒为1:1)结合的CS-DNA纳米复合物组以及PEG-CS-DNA纳米复合物60ul、80ul、100ul、120ul转染血管内皮细胞0-96h,并以相应的裸质粒组以及空白组作为对照。3)荧光显微镜下观察转染细胞绿色荧光的表达,流式细胞仪检测转染效率,MTT法测定细胞活性。3 .载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒转染体系抑制大鼠血管内皮细胞ACE表达的研究1)应用Real-time荧光定量PCR检测各组PEG-CS-DNA纳米复合物转染前后ACE mRNA的表达.并以裸质粒和空白组为对照。2)于转染前及转染后的24h、48h、72h收集各组细胞,用Western-blot法检测ACE蛋白的表达。3)于转染前及转染后的72h收集培养液2mL,用酶联免疫方法检测ACE以及Ang-Ⅱ的含量。4.载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒转染体系介导RNAi对自发性高血压大鼠的影响1)研究对象为12周龄成年雄性自发性高血压大鼠(SHR)和高血压模型对照鼠,采用尾静脉注射DNA含量为25ug,无菌生理盐水稀释后500ul载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米复合物, 10天重复给药一次。并以每日灌胃给予洛丁新10mg/日/只作为对照,同时设SHR空白对照组、壳聚糖对照组以及正常血压对照组,分别尾静脉注射500ul无菌生理盐水或相同浓度的壳聚糖纳米液。2)分别于注射前及注射后每1-3天的相同时间点采用尾袖法在安静环境中测量大鼠清醒状态下尾动脉收缩压(SBP)和心率。3)荧光定量RT-PCR或Western-blot法检测心肌、主动脉、肾脏ACE mRNA或蛋白的表达,并应用酶联免疫法检测各组血清ACE以及Ang-Ⅱ含量的变化,全自动生化分析仪检测肝肾功能。4)实验结束时,行左侧颈动脉插管测定左心室功能血流动力学检查,并称取全心(HW)、左室重量(LW),求全心/体重、左心室/体重比值,并且制备心、肾及主动脉组织冰冻切片,荧光显微镜下检测载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒的分布,光镜以及透射电镜行心肌组织学检查。结果:1.载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒制备以及生物学特性1.1经紫外分光光度计检测质粒DNA浓度为0.5ug/ul,纯度为1.88。1.2各因素对壳聚糖纳米复合物理化性质的影响:(1)壳聚糖纳米粒的粒径随着溶液pH值的升高而增大,当pH值为5.5时的PEG壳聚糖纳米粒平均粒径125.8±5.6nm左右,大小均匀,多分散度最小,分布比较集中,zeta电位为正,有利于与带负电荷的质粒结合。(2)PEG化后也对粒径以及zeta电位无明显影响,但是与壳聚糖相同条件相比,分散度均明显减小,可见更适合制备均匀的纳米粒,利于和质粒结合。(3)壳聚糖与质粒体积比(质量比)为1:1制备的壳聚糖纳米粒平均粒径较小,故通过细胞膜的通透性较好,多分散度较小,分布比较集中, zeta电位也为正值,有利于与带负电荷的质粒结合。1.3各因素对壳聚糖与质粒结合力的影响:(1)壳聚糖纳米以及PEG化壳聚糖纳米质粒复合物均有效结合质粒,由于中和了质粒所带的负电荷,凝胶电泳时,质粒不出孔,而裸质粒则出孔。(2)PH<7时壳聚糖分子中大部分的氨基带正电荷能与质粒DNA有效地结合质粒不出孔。(3)在体积比为1:1、1:2、1:3时,壳聚糖纳米粒能有效地结合质粒.1.4各因素对复合物包埋率的影响:(1)pH值为5.5时的壳聚糖纳米复合物的DNA包埋率为最高,为(90.43±3.9)%。(2)各组经PEG表面修饰后包埋率明显增高。(3)当体积比为1:1,1:2时包埋率较高,分别为(88.87±13.2)%与(80.13±12.9)%,两组间无显著差异;之后随着该比例增高,包埋率明显下降。1.5各因素对复合物体外释放的影响:(1)CS-DNA纳米复合物在PBS溶液pH值为3.5-7.5时释放的情况基本相同,均存在开始阶段的爆破释放,释放曲线前段接近直线,约4天(96小时)后,释放量开始稳定,释放曲线缓慢上升,平稳维持释放8天左右。而纳米粒在pH值为9.0的PBS溶液中快速释放,只释放了4天左右。(2)在固定PH=5.5时,各不同体积比例的载基因复合物PBS溶液释放均存在开始阶段的爆破释放,释放曲线快速上升,约4天(96小时)后,释放量开始稳定,释放曲线缓慢上升,但是释放持续时间随着体积比的增大而缩短,在体积比为1:1时,释放时间最长,平稳维持释放8天左右;体积比为1:5时,释放时间最短,仅维持4天左右。(3)取体积比为1:1,pH=5.5的载ACEshRNA壳聚糖纳米粒经PEG化后,没有影响复合物的体外释放的爆破释放特点,约4天(96小时)后,释放量开始稳定,释放曲线缓慢上升,但是释放持续时间延长至10天左右。1.6 DNaseⅠ消化实验:(1)PEG化载ACEshRNA壳聚糖纳米在体积比为1:1—1:3均能有效抵抗DNA降解,质粒被完全阻滞于加样孔中,体积比为1:4,1:5的载基因壳聚糖纳米复合物则可以显示条带,说明对核酸酶的保护作用降低。(2)PEG化壳聚糖纳米粒能有效地保护质粒不被DnaseⅠ消化,复合物不出孔,而裸质粒则完被DnaseⅠ消化,加样孔内以及条带消失。(3)PH=3、5.5、7时,均能有效地对质粒DNA有保护核酸酶降解的作用,当PH=11.0时,则可以看到明显的条带,表明对核酸酶的保护作用降低。2.载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒对血管内皮细胞转染条件的筛选2.1免疫荧光法鉴定证实培养获得稳定的大鼠血管内皮细胞,细胞存活率达95%以上。2.2转染效率的测定:(1)用荧光显微镜观察可以看到有绿色荧光的表达,而裸质粒组和空白对照组均未见荧光表达。(2)流式细胞仪检测转染率:1)未经PEG化修饰的壳聚糖质粒纳米粒对内皮细胞的转染率均很低,最高达(26.0±3.9)%,PEG对壳聚糖质粒纳米复合物进行化学修饰后,转染效率比修饰前的转染效率明显有提高,最高达(59.4±5.2)%。2)PEG-CS/DNA纳米复合物的量为100ul,即质粒DNA含量为25ug时转染率最高,在一定的范围内转染率的高低与转染的复合物量呈正比,超出一定的量转染率反而开始下降。3)固定转染的体积时,转染不同时间,随着时间的延长,转染效率逐渐增高,72h达高峰(57.1±7.1),(p<0.05);96小时开始有所下降,但仍显著高于0h(p<0.05)。2.3各转染条件下载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米复合物转染细胞毒性的测定:当转染的复合物<100ul时与空白对照组比较差异无统计学意义,说明对细胞无毒性作用;而当复合物的量为120 ul时在转染的24h时细胞生长出现了明显的抑制现象,并且随着时间的延长抑制作用逐渐增大(p<0.05)。3.载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒转染体系抑制大鼠血管内皮细胞ACE表达的研究3.1转染前后不同组ACE基因mRNA表达的变化:转染载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米复合物后24小时细胞ACE mRNA表达水平下降达(14.7±5.9)%,48小时达(53.6±5.4)%,与空白对照组和质粒对照组相比有统计学差异(均P﹤0.05),72小时为(60.1±2.1)%。3.2转染前后不同组细胞ACE蛋白表达的变化:PEG-CS/DNA组转染后24小时细胞ACE蛋白表达无明显变化,48小时明显降低,与空白对照组和质粒对照组相比有统计学差异(P﹤0.05),72小时更低(P﹤0.01),而空白对照组与质粒对照组转染前后各时间点ACE的蛋白表达无明显变化,与RT-PCR结果一致。3.3血管内皮细胞培养液中ACE以及Ang-Ⅱ的含量;PEG-CS/DNA组转染72小时后,细胞培养液中的ACE与Ang-Ⅱ含量明显减少,与空白对照组以及裸质粒组相比有显著差别(P<0.05)。可见,载ACEshRNA PEG-CS纳米转染系统不仅可以在分子蛋白水平显著下调ACE基因,而且在功能上也显著减少ACE的含量,降低Ang-Ⅱ的合成。4.载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒转染体系介导RNAi对自发性高血压大鼠的影响4.1治疗前后尾动脉压及心率的变化:SHR各组之间干预前尾动脉压差异无统计学意义(P﹥0.05),SHR各组干预前尾动脉压均显著高于正常血压对照组(P﹤0.01)。SHR基因治疗组于首次注射后第3天,尾动脉压显著下降约(22±4)mmHg,与治疗前比较有显著性差异(P﹤0.05),之后下降缓慢,降压作用可持续8天左右,最大降压幅度达33mmHg,于注射后约11天时血压开始回升;第2次注射后,尾动脉压再次明显下降约(24±5)mmHg,降压作用可持续10天左右,血压回升,最大降压幅度约25mmHg。两次注射后最大降压幅度累积达50mmHg。洛丁新治疗组开始使用后第3天血压持续降低,于第13天达最大降压幅度39 mmHg,明显低于基因治疗组最大降压幅度(p<0.05)。随后7天内血压无明显下降。SHR空白对照组和壳聚糖对照组尾动脉压持续升高。正常血压对照组尾动脉压无明显变化。各组大鼠治疗前后心率均无明显变化(P >0.05),4.2 PEG-CS-EGFP-ACE-shRNA的组织器官分布情况:心脏、主动脉、肾脏组织都可见大量绿色荧光表达,与ACE在体内分布一致,说明载ACEshRNA-PEG-CS纳米载体经尾静脉注射后可分布在富含ACE的组织中。4.3 PEG-CS-EGFP-ACE-shRNA转染72h后对心,肾,主动脉的ACE功能的下调作用: 1)RT-PCR结果:SHR基因治疗组心肌、主动脉、肾脏的ACE mRNA表达均较SHR空白对照组、SHR壳聚糖对照组、药物治疗组显著降低,差异有统计学意义(P﹤0.05),而与正常血压对照组无统计学差异(P﹥0.05)。说明SHR大鼠在尾静脉注射PEG-CS-EGFP-ACE-shRNA后,能显著降低ACE mRNA的表达。2)Western blot结果:SHR基因治疗组心肌、主动脉、肾脏的ACE蛋白表达均较SHR空白对照组、SHR病毒对照组以及药物治疗组显著降低,差异有统计学意义(P﹤0.05),而与正常血压对照组无统计学差异(P﹥0.05),与RT-PCR结果一致。说明SHR大鼠在尾静脉注射载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米粒后,随着ACE mRNA的表达降低,相应功能蛋白的表达也随之降低。3)对血清ACE以及Ang-Ⅱ的含量的影响:转染72小时后,SHR基因治疗组ACE以及Ang-Ⅱ显著降低,低于SHR空白对照组、壳聚糖对照组、以及药物治疗组,差异有统计学意义(P﹤0.05),而与正常血压对照组无统计学差异(P﹥0.05)。SHR药物治疗组ACE治疗前后无明显变化,但是Ang-Ⅱ显著降低,证实ACEI类药物可以抑制Ang-Ⅱ的合成。4.4对左室结构以及功能的影响:1)血流动力学检测左室功能:左室舒张压(LVDP)、左室舒张末压(LVDEP)以及最大舒张速度(- dp/dtmax)在SHR各组均高于正常血压组,其中空白对照组、壳聚糖对照组明显高于药物治疗组以及基因治疗组(P<0.05),可见高血压早期即有舒张功能不全,并且基因治疗组与药物治疗组均可显著改善舒张功能不全,两者相比明显有差别,前者更显著降低LVDP与(- dp/dtmax),说明载ACEshRNA-PEG-壳聚糖纳米复合物能更有效地显著改善高血压时的舒张功能不全。2)对全心/体重、左心室/体重的影响:SHR空白对照组和壳聚糖对照组的全心/体重和左心室/体重显著高于正常血压血压组(P﹤0.05),提示未经治疗的SHR有明显的心肌肥厚现象。药物治疗组和基因治疗组上述指标均显著下降(P﹤0.05),其后者降低更明显,但均未降到正常血压对照组水平,可见与ACEI类药物相比,载ACE-shRNA-PEG-壳聚糖纳米复合物改善心肌肥厚的作用更明显。3)组织学观察:光镜下观察到SHR空白对照组和SHR壳聚糖对照组较正常血压对照组心肌细胞明显肥大,SHR基因治疗组即尾静脉注射载ACE-shRNA-PEG-壳聚糖纳米复合物和药物治疗组均使心肌细胞肥大明显减轻。电镜下观察到:SHR空白对照组和壳聚糖对照组相比, SHR基因治疗组以及药物治疗组心肌细胞核膜完整,肌原纤维清晰,排列较整齐,横纹清楚可见,线粒体无肿胀,但局部可见少量增多,心肌间质未见明显胶原纤维增生,说明载ACE-shRNA-PEG-壳聚糖纳米复合物与ACEI类药物都可以改善SHR心肌超微结构的改变。4.5对肝肾功能的影响:各组大鼠之间肝肾功能指标无统计学差异(P﹥0.05),表明载ACE-shRNA-PEG-壳聚糖纳米复合物对肝肾功能无影响。结论1所制备的载ACE-shRNA-PEG-壳聚糖纳米大小均匀,粒径分布范围较窄。并且筛选出在PH=5.5时,与质粒体积比为1:1时,以PEG壳聚糖纳米粒作为基因载体有良好的DNA包埋率,体外释药反应呈现缓释的特性,并且能有效地抑制核酸酶对质粒DNA的降解,为后期体外转染培养细胞以及体内转染提供了实验基础。2.经过转染条件的筛选以及对壳聚糖纳米的PEG表面修饰,找到了较佳转染条件:DNA25μg、DNA:CS纳米粒体积比为1:1,转染72小时为较大转染效率。3.本实验合成的载ACEshRNA-PEG-CS纳米转染体系介导的RNA干扰,在体外培养的大鼠血管内皮细胞中成功发挥了ACE基因表达下调作用以及抑制ACE与Ang-Ⅱ的合成等生物学效应,证明了PEG-CS/DNA转染载体可以有效地将目的基因转入靶细胞并且发挥相应的基因下调以及功能学效应。4.PEG-CS纳米粒介导的ACE-shRNA经尾静脉注射入自发性高血压大鼠体内后,成功发挥了基因沉默作用,有效抑制了ACE mRNA及相应功能蛋白的表达,与传统长效ACEI类药物相比,降压幅度更大、一次给药可以维持10天左右降压效果,并且显著改善了心肌重构,以及心脏舒张功能。因此,运用PEG-CS纳米粒介导的ACE-shRNA发挥的RNA干扰作用进行降压治疗是一种具用潜力的治疗高血压的新策略。