论文部分内容阅读
四川泡菜是我国优秀发酵蔬菜的代表,蕴含着丰富的微生物资源。而在食品尤其是发酵食品中往往有生物胺的存在,外源摄入过多的生物胺会对人体造成损害,为此控制发酵食品中的生物胺含量显得尤为重要,最好的控制方法即通过微生物降解生物胺。因此,本论文先通过Illumina高通量测序的方法对优良泡菜及泡菜发酵过程中的细菌多样性及变化有一个全面的认识,并在此基础上以有潜力作为发酵剂、耐受人体胃肠环境且能有效降解生物胺为筛选指标,获得了一株能高效降解生物胺的植物乳杆菌,同时确定sufⅠ基因在降解生物胺过程中起重要作用。针对采集的20个四川农家自制泡菜样品进行感官评定,从中确定3个感官评定得分较高的样品进行细菌多样性分析,结果显示四川泡菜中以乳杆菌属为主,占比达到76-89%,是老坛中的优势菌。以老坛水作引子的发酵过程中发酵启动时魏斯氏菌属可达到74.5%,而之后则在10%左右,取而代之成为优势菌的是乳杆菌属,含量达到80-85%。说明泡菜发酵中启动菌为魏斯氏菌属,发酵的关键菌为乳杆菌属,同时表明四川泡菜是优良的微生物资源,可用于益生菌的分离和筛选,以及发酵食品直投式乳酸菌菌剂开发。针对从泡菜样品中分离出的乳酸菌,采用休止细胞与生物胺共培养的方法,根据培养前后生物胺的降解率,发现其中5株植物乳杆菌和1株布氏乳杆菌对生物胺有显著降解作用,其中植物乳杆菌M6对色胺,苯乙胺,腐胺,尸胺,组胺,酪胺,亚精胺,精胺的降解率分别为86.74%,38.94%,63.90%,53.12%,96.69%,32.81%,85.68%,92.15%,对总胺的降解率达到67.33%。进一步从分子层面探究生物胺降解机理,结果表明除布氏乳杆菌外,筛选出的5株植物乳杆菌中均含生物胺降解相关基因sufⅠ基因。由于5株植物乳杆菌对生物胺的降解能力也不尽相同,于是对5株植物乳杆菌的sufⅠ基因全基因进行测序并推测其表达产物,发现其中4株植物乳杆菌对应的sufⅠ基因表达产物分别存在一个位点与其他4株不同,推测SufⅠ蛋白空间结不同导致生物胺降解率差异。同时,将植物乳杆菌M6的sufⅠ基因与大肠杆菌表达载体p ET-28b连接,获得重组质粒p ET-28b-sufⅠ,将重组质粒导入大肠杆菌表达宿主菌BL21中培养,对表达产物进行分离纯化,最终获得了SufⅠ蛋白,将SufⅠ蛋白与生物胺共反应的结果是,苯乙胺,腐胺,尸胺,组胺,酪胺,亚精胺,精胺的降解率分别为58.07%,61.49%,75.23%,75.79%,81.07%,58.57%,87.38%,94.89%,总胺降解率为73.19%。本研究结果显示植物乳杆菌M6能够高效降解生物胺,降解作用与sufⅠ基因密切相关。本文系统地研究了四川泡菜的细菌多样性构成及发酵过程中动态变化,并从泡菜样品中筛选出一株对生物胺具有很好降解作用的乳酸菌,植物乳杆菌M6,同时确定了生物胺降解相关基因并分离到了相关蛋白。论文研究结果不仅为发酵食品直投式乳酸菌菌剂开发提供了参考,也提供了优良菌株及功能性蛋白质,具有一定的理论意义和实际应用价值。