【摘 要】
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[目的]本课题旨在利用非标定量蛋白质组学分析酸蚀条件下牙本质的差异表达蛋白,并进一步明确FAM20C对人牙髓干细胞增殖、迁移和分化的影响。[方法]在患者知情同意下,收集100颗完整、无龋坏的第三磨牙,患者均就诊于联勤保障部队第九二O医院口腔科。将拔除的智齿进行牙本质切片（厚约1mm）,设置实验组（35%磷酸凝胶酸蚀10s）和对照组。根据分组对牙本质样品分别提取总蛋白,蛋白经胰酶酶解成肽段,然后将肽
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[目的]本课题旨在利用非标定量蛋白质组学分析酸蚀条件下牙本质的差异表达蛋白,并进一步明确FAM20C对人牙髓干细胞增殖、迁移和分化的影响。[方法]在患者知情同意下,收集100颗完整、无龋坏的第三磨牙,患者均就诊于联勤保障部队第九二O医院口腔科。将拔除的智齿进行牙本质切片（厚约1mm）,设置实验组（35%磷酸凝胶酸蚀10s）和对照组。根据分组对牙本质样品分别提取总蛋白,蛋白经胰酶酶解成肽段,然后将肽段进行液相色谱-质谱联用分析;将得到的二级质谱数据使用定量蛋白质组学软件包Maxquant进行检索并筛选差异蛋白,筛选标准设置为:差异倍数≥1.5倍,p值≤0.05。将筛选到的差异蛋白进行生物信息学分析,通过基因本体论分析其生物学功能;使用KEGG通路数据库进行通路富集分析,以寻找差异蛋白的显著性富集通路;再将差异表达蛋白与STRING蛋白网络数据库相互作用进行对比后,获得差异蛋白的互作关系。结合文献筛选出酸蚀后蛋白表达量显著上调的高尔基体酪蛋白激酶（FAM20C）,通过MTT、细胞克隆、细胞划痕和Transwell实验观察不同浓度 FAM20C 对人牙髓干细胞（human Dental pulp stem cells,hDPSCs）)增殖和迁移能力的影响;再使用茜素红染色、RT-qPCR和Western Blot检测FAM20C对hDPSCs成牙/成骨向分化的影响。[结果]蛋白定量方法具有良好的准确性,差异性小,重复性好,质谱鉴定出的肽段长度的分布符合质控要求;两组蛋白样品质谱分析共得到2090903.0张二级谱图。其中有效可利用图谱30296.0张,共鉴定出2756.0条肽段,包括2014.0条特异性肽段;共鉴定蛋白418.0个,其中能够被定量的蛋白有266.0个。我们将变化阈值大于1.5倍的差异表达量定义为显著上调的蛋白,小于1/1.5作定义为显著下调的蛋白,结果中46个蛋白上调,56个蛋白下调;以1.5倍差异倍数筛选所得102个蛋白进行GO二级注释分类、亚细胞结构定位、COG/KOG功能分类、GO富集分析、KEGG通路富集结果、蛋白互作用网络等一系列技术分析,所得本实验相关蛋白表达差异显著的有Gas6、FAM20C、胰岛素样生长因子结合蛋白和成骨分化相关蛋白等。使用不同浓度的FAM20C共培养hDPSCs,发现随着FAM20C浓度的增高,其增殖和迁移能力增强;在浓度为1000ng/mL时可以明显促进hDPSCs的成牙/成骨向分化。[结论]本实验采用非标定量蛋白质组学技术,揭示了酸蚀条件下牙本质的蛋白质组成,共有418种蛋白质被鉴定,其中差异表达蛋白有102个,包括46个下调蛋白质和56个上调蛋白质。其中牙本质酸蚀后显著上调的FAM20C可以促进hDPSCs的增殖、迁移和成牙/成骨向分化能力。
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