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摘要 [目的]研究苹果片在干制条件下及复合护色剂处理后的蛋白质水平变化。[方法]采用Label free技术分析了苹果片在干制条件下及复合护色剂处理后果肉中蛋白质组学的变化。[结果]一共检测到319个差异蛋白上调，590个下调，分别参与了多个不同的代谢途径。其中，催化活性catalytic activity（48个差异表达蛋白）、氧化还原过程oxidationreduction process（18个差异表达蛋白）、应激反应response to stress（17个差异表达蛋白）等多个途径的蛋白差异表达明显。KEGG富集分析结果显示，共有2个基因通路显著富集，在氧化磷酸化Oxidative phosphorylation中有5个蛋白参与显著富集；在代谢通路Metabolic pathways中有11个蛋白参与显著富集。这2个途径与抗氧化、褐变酶合成途径有关。[结论]该研究首次在苹果片干制条件下及复合护色剂处理后采用蛋白质组学的方法分析差异蛋白的表达变化，为复合护色剂在实践中果蔬护色提供科学依据。
关键词 复合护色剂；苹果片；干制；蛋白质组学；表达分析；GO富集分析
中图分类号 TS255.42 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）02-0070-05
Abstract [Objective] To investigate proteins expression in complex colourprotective reagents treated apple slices during drying. [Method]We analyzed proteomic change in apple slices treated with complex colourprotective reagents during drying using Label free technology. [Result]319 differential proteins were upregulated， 590 differential proteins were downregulated. They involved into different metabolism pathways， respectively. Among them， differential proteins expression in catalytic activity （48 proteins）， oxidationreduction process （18 proteins）， response to stress （17 proteins） pathways became very obvious. KEGG enrichment analysis showed that two gene pathways were obviously enriched. 5 proteins involved into Oxidative phosphorylation pathway enrichment.11 proteins involved into metabolic pathways enrichment. The two pathways were related to antioxidation and enzymes browning procedures. [Conclusion] Proteomic change in complex colourprotective reagents treated apple slices during drying was first reported. This study provided a science support to application of complex colourprotective reagents in fruits and vegetables browning inhibition.
Key words Complex colourprotective reagents；Apple slices；Drying；Proteomics；Expression analysis；GO enrichment analysis
蘋果是一种非常适合于工业化生产的水果，新鲜苹果经分级、清洗、整修、去皮、切分、保鲜、包装等处理，供消费者立即食用或餐饮业使用。色泽是判断加工苹果非常重要的一个指标，切割苹果的主要质量问题是褐变。由于在加工过程（如去皮、切分等）中破坏了多酚氧化酶（PPO）和酚类物质在细胞内通过一系列膜系统的区域化分布，因而酶和底物的酚类物质在有氧气的条件下相互接触导致酶促褐变的发生，从而严重影响苹果的颜色、风味、营养和品质，因此防止加工苹果的氧化褐变尤为重要[1-2]。苹果褐变的主要原因是其组织内的酚类物质在多酚氧化酶的作用下氧化为醌类，而醌类物质会进一步聚合而形成黑色素，进而发生酶促褐变[3]。
蛋白质组是指由一个基因组、一个细胞或组织所表达的所有蛋白质[4-5]。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新的研究领域，其目的在于阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，包括蛋白质的表达、翻译后的修饰、蛋白结构、蛋白与蛋白之间相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识[6-7]。苹果片干制是保存苹果的一种重要方法，然而在干制过程中，果肉极易发生褐变，使其商品价值大大降低，为此，研制了一种能有效降低果肉褐变的复合护色剂。笔者通过蛋白组学分析技术分析了干制苹果片在护色前后蛋白的差异表达，为揭示复合护色剂抑制苹果片果肉褐变的机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料 试验材料红富士苹果购自太谷县。
1.2 方法
1.2.1 样品处理。
洗净苹果，将苹果切成 1 mm 的薄片，均等分成2份，其中1份放置于空气中 4 h，另1份浸泡于复合护色液中 4 h，将2份苹果放置于 45 ℃烘箱中烘至恒重。
1.2.2 蛋白质提取。
蛋白质提取按照参考文献[8]的方法进行。
1.2.3 蛋白质酶解。
蛋白质酶解按照参考文献[8]的方法进行。
1.2.4 色谱质谱检测流程。
检测用 LTQ orbitrapVelos液质联用仪配备戴安ultramate 3000 nano-UPLC 进行分析，上机量 10 μL，首先进入保护柱（C18 PepMap100，300 μm×1 mm，5 μm，100 ），随后进入分析柱（AcclaimPepMap C18，15 cm×75 μm，2 μm，100 ，Dionex）以流速 0.2 μL/min 进行分析。
质谱参数：阳离子模式，CID 碰撞模式，120 000 分辨率，质量范围 350～1 800，NCE 为 35%，前 top15 离子强度用于 MS/MS 分析。
1.3 分析方案
Orbitrap原始数据定性定量方法：对获得的Label free蛋白质原始数据.raw，用Label free定性定量软件maxquant（1.5.0.12）结合搜库定性软件Andromeda，对每个样本进行定性定量，参考蛋白质数据库为uniprot（收录了共34 361条记录）。具体的定性和检索方法按照参考文献[8]的方法进行。
2 结果与分析
2.1 差异蛋白表达分析
定性定量分析可以识别到1 797个蛋白（unique peptide≥1）。最终获得的差异蛋白总数为909个，其中下调总数为590个，上调总数为319个[8]。
2.2 差异蛋白GO富集分析
Gene Ontology显著性富集分析以GO term为单位，找出与基因组的所有表达基因背景相比，在差异表达基因中显著性富集的GO term。检验P值，将用P≤0.05的GO term定义为在差异表达基因中显著富集的GO term。通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达基因行驶的主要生物学功能。其中BP为biological process（生物学过程）、MF为Molecular Function（分子功能）、CC为Cellular Component（细胞组件）。用GO数据库注释将差异蛋白，分析差异蛋白在本体论水平上的功能富集，结果显示，差异蛋白分别在Biological process、Cellular component和Molecular function这3个水平上有显著富集。其中差异蛋白表达数≥10的有催化活性catalytic activity（48个差异表达蛋白）、氧化还原过程oxidationreduction process（18个差异表达蛋白）、应激反应response to stress（17个差异表达蛋白）、碳水化合物代谢过程carbohydrate metabolic process（13个差异表达蛋白）、羧酸代谢过程carboxylic acid metabolic process（11个差异表达蛋白）、酮酸代谢过程oxoacid metabolic process（11个差异表达蛋白）、有机酸代谢过程organic acid metabolic process（11个差异表达蛋白）、非生物刺激反应response to abiotic stimulus（10个差异表达蛋白）。通过注释信息可知在果肉干制过程中代谢活力整体上功能集中在催化过程和氧化还原过程（表1、图1）。
2.3 差异基因的pathway富集分析
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系统分析基因功能、基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。KEGG的一个数据库是GENES，另一个数据库是LIGAND。KEGG提供的整合代谢途径（pathway）查询十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的代谢途径，而且对催化各步反应的酶进行了全面的注解，包含有氨基酸序列、PDB库的链接等。
KEGG是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具。
用KEGG数据库注释差异蛋白，分析差异蛋白在KEGG代谢通路中的富集，对差异蛋白进行富集分析，取P<0.05为最终差异的代谢通路。结果显示，共有2个基因通路显著富集，在氧化磷酸化Oxidative phosphorylation中有5个蛋白参与显著富集；在代谢通路Metabolic pathways中有11个蛋白参与显著富集。这2个途径与抗氧化、褐变酶合成途径有关，说明在果片干制过程中的褐变酶与抗氧化酶蛋白可能参与褐变代谢相关酶的生成或抑制过程。这个结果与GO富集分析结果一致（表2、图2）。
3 结论
蘋果片经复合护色剂处理后，经干制后取样分析，结果表明，差异蛋白在Biological process、Cellular component和Molecular function 这3个水平上均有显著富集。其中差异蛋白表达数≥10的有催化活性catalytic activity（48个差异表达蛋白）、氧化还原过程oxidationreduction process（18个差异表达蛋白）、应激反应response to stress（17个差异表达蛋白）等。KEGG分析表明，共有2个基因通路显著富集。 参考文献
[1] PERSIC M，MIKULICPETKOVSEK M，SLATNAR A，et al.Chemical composition of apple fruit，juice and pomace and the correlation between phenolic content，enzymatic activity and browning[J].LWTFood science and technology，2017，82：23-31.
[2] HEMACHANDRAN H，ANANTHARAMAN A，MOHAN S，et al.Unraveling the inhibition mechanism of cyanidin3sophoroside on polyphenol oxidase and its effect on enzymatic browning of apples[J].Food chemistry，2017，227：102-110.
[3] SUKHONTHARA S，KAEWKA K，THEERAKULKAIT C.Inhibitory effect of rice bran extracts and its phenolic compounds on polyphenol oxidase activity andbrowning in potato and apple puree[J].Food chemistry，2016，190：922-927.
[4] DU L N，SONG J，PALMER L C，et al.Quantitative proteomic changes in development of superficial scald disorder and its response to diphenylamine and 1MCP treatments in apple fruit[J].Postharvest biology and technology，2017，123：33-50.
[5] CHANG C L.Proteomic identification of a potential sex biomarker for 2 fruit fly species at pupal stage[J].Journal of Asiapacific entomology，2017，20：125-131.
[6] D’AMBROSIO C，ARENA S，ROCCO M，et al.Proteomic analysis of apricot fruit during ripening[J].Journal of proteomics，2013，78：39-57.
[7] SNCHEZBEL P，EGEA I，SNCHEZBALLESTA T T，et al.Understanding the mechanisms of chilling injury in bell pepper fruits using the proteomic approach[J].Journal of proteomics，2012，75（17）：5463-5478
[8] 李新明，郭志利，李群，等.無硫复合护色剂处理的干制苹果片中差异蛋白表达的分析[J].安徽农业科学，2017，45（28）：71-73.
关键词 复合护色剂；苹果片；干制；蛋白质组学；表达分析；GO富集分析
中图分类号 TS255.42 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）02-0070-05
Abstract [Objective] To investigate proteins expression in complex colourprotective reagents treated apple slices during drying. [Method]We analyzed proteomic change in apple slices treated with complex colourprotective reagents during drying using Label free technology. [Result]319 differential proteins were upregulated， 590 differential proteins were downregulated. They involved into different metabolism pathways， respectively. Among them， differential proteins expression in catalytic activity （48 proteins）， oxidationreduction process （18 proteins）， response to stress （17 proteins） pathways became very obvious. KEGG enrichment analysis showed that two gene pathways were obviously enriched. 5 proteins involved into Oxidative phosphorylation pathway enrichment.11 proteins involved into metabolic pathways enrichment. The two pathways were related to antioxidation and enzymes browning procedures. [Conclusion] Proteomic change in complex colourprotective reagents treated apple slices during drying was first reported. This study provided a science support to application of complex colourprotective reagents in fruits and vegetables browning inhibition.
Key words Complex colourprotective reagents；Apple slices；Drying；Proteomics；Expression analysis；GO enrichment analysis
蘋果是一种非常适合于工业化生产的水果，新鲜苹果经分级、清洗、整修、去皮、切分、保鲜、包装等处理，供消费者立即食用或餐饮业使用。色泽是判断加工苹果非常重要的一个指标，切割苹果的主要质量问题是褐变。由于在加工过程（如去皮、切分等）中破坏了多酚氧化酶（PPO）和酚类物质在细胞内通过一系列膜系统的区域化分布，因而酶和底物的酚类物质在有氧气的条件下相互接触导致酶促褐变的发生，从而严重影响苹果的颜色、风味、营养和品质，因此防止加工苹果的氧化褐变尤为重要[1-2]。苹果褐变的主要原因是其组织内的酚类物质在多酚氧化酶的作用下氧化为醌类，而醌类物质会进一步聚合而形成黑色素，进而发生酶促褐变[3]。
蛋白质组是指由一个基因组、一个细胞或组织所表达的所有蛋白质[4-5]。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新的研究领域，其目的在于阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，包括蛋白质的表达、翻译后的修饰、蛋白结构、蛋白与蛋白之间相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识[6-7]。苹果片干制是保存苹果的一种重要方法，然而在干制过程中，果肉极易发生褐变，使其商品价值大大降低，为此，研制了一种能有效降低果肉褐变的复合护色剂。笔者通过蛋白组学分析技术分析了干制苹果片在护色前后蛋白的差异表达，为揭示复合护色剂抑制苹果片果肉褐变的机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料 试验材料红富士苹果购自太谷县。
1.2 方法
1.2.1 样品处理。
洗净苹果，将苹果切成 1 mm 的薄片，均等分成2份，其中1份放置于空气中 4 h，另1份浸泡于复合护色液中 4 h，将2份苹果放置于 45 ℃烘箱中烘至恒重。
1.2.2 蛋白质提取。
蛋白质提取按照参考文献[8]的方法进行。
1.2.3 蛋白质酶解。
蛋白质酶解按照参考文献[8]的方法进行。
1.2.4 色谱质谱检测流程。
检测用 LTQ orbitrapVelos液质联用仪配备戴安ultramate 3000 nano-UPLC 进行分析，上机量 10 μL，首先进入保护柱（C18 PepMap100，300 μm×1 mm，5 μm，100 ），随后进入分析柱（AcclaimPepMap C18，15 cm×75 μm，2 μm，100 ，Dionex）以流速 0.2 μL/min 进行分析。
质谱参数：阳离子模式，CID 碰撞模式，120 000 分辨率，质量范围 350～1 800，NCE 为 35%，前 top15 离子强度用于 MS/MS 分析。
1.3 分析方案
Orbitrap原始数据定性定量方法：对获得的Label free蛋白质原始数据.raw，用Label free定性定量软件maxquant（1.5.0.12）结合搜库定性软件Andromeda，对每个样本进行定性定量，参考蛋白质数据库为uniprot（收录了共34 361条记录）。具体的定性和检索方法按照参考文献[8]的方法进行。
2 结果与分析
2.1 差异蛋白表达分析
定性定量分析可以识别到1 797个蛋白（unique peptide≥1）。最终获得的差异蛋白总数为909个，其中下调总数为590个，上调总数为319个[8]。
2.2 差异蛋白GO富集分析
Gene Ontology显著性富集分析以GO term为单位，找出与基因组的所有表达基因背景相比，在差异表达基因中显著性富集的GO term。检验P值，将用P≤0.05的GO term定义为在差异表达基因中显著富集的GO term。通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达基因行驶的主要生物学功能。其中BP为biological process（生物学过程）、MF为Molecular Function（分子功能）、CC为Cellular Component（细胞组件）。用GO数据库注释将差异蛋白，分析差异蛋白在本体论水平上的功能富集，结果显示，差异蛋白分别在Biological process、Cellular component和Molecular function这3个水平上有显著富集。其中差异蛋白表达数≥10的有催化活性catalytic activity（48个差异表达蛋白）、氧化还原过程oxidationreduction process（18个差异表达蛋白）、应激反应response to stress（17个差异表达蛋白）、碳水化合物代谢过程carbohydrate metabolic process（13个差异表达蛋白）、羧酸代谢过程carboxylic acid metabolic process（11个差异表达蛋白）、酮酸代谢过程oxoacid metabolic process（11个差异表达蛋白）、有机酸代谢过程organic acid metabolic process（11个差异表达蛋白）、非生物刺激反应response to abiotic stimulus（10个差异表达蛋白）。通过注释信息可知在果肉干制过程中代谢活力整体上功能集中在催化过程和氧化还原过程（表1、图1）。
2.3 差异基因的pathway富集分析
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系统分析基因功能、基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。KEGG的一个数据库是GENES，另一个数据库是LIGAND。KEGG提供的整合代谢途径（pathway）查询十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的代谢途径，而且对催化各步反应的酶进行了全面的注解，包含有氨基酸序列、PDB库的链接等。
KEGG是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具。
用KEGG数据库注释差异蛋白，分析差异蛋白在KEGG代谢通路中的富集，对差异蛋白进行富集分析，取P<0.05为最终差异的代谢通路。结果显示，共有2个基因通路显著富集，在氧化磷酸化Oxidative phosphorylation中有5个蛋白参与显著富集；在代谢通路Metabolic pathways中有11个蛋白参与显著富集。这2个途径与抗氧化、褐变酶合成途径有关，说明在果片干制过程中的褐变酶与抗氧化酶蛋白可能参与褐变代谢相关酶的生成或抑制过程。这个结果与GO富集分析结果一致（表2、图2）。
3 结论
蘋果片经复合护色剂处理后，经干制后取样分析，结果表明，差异蛋白在Biological process、Cellular component和Molecular function 这3个水平上均有显著富集。其中差异蛋白表达数≥10的有催化活性catalytic activity（48个差异表达蛋白）、氧化还原过程oxidationreduction process（18个差异表达蛋白）、应激反应response to stress（17个差异表达蛋白）等。KEGG分析表明，共有2个基因通路显著富集。 参考文献
[1] PERSIC M，MIKULICPETKOVSEK M，SLATNAR A，et al.Chemical composition of apple fruit，juice and pomace and the correlation between phenolic content，enzymatic activity and browning[J].LWTFood science and technology，2017，82：23-31.
[2] HEMACHANDRAN H，ANANTHARAMAN A，MOHAN S，et al.Unraveling the inhibition mechanism of cyanidin3sophoroside on polyphenol oxidase and its effect on enzymatic browning of apples[J].Food chemistry，2017，227：102-110.
[3] SUKHONTHARA S，KAEWKA K，THEERAKULKAIT C.Inhibitory effect of rice bran extracts and its phenolic compounds on polyphenol oxidase activity andbrowning in potato and apple puree[J].Food chemistry，2016，190：922-927.
[4] DU L N，SONG J，PALMER L C，et al.Quantitative proteomic changes in development of superficial scald disorder and its response to diphenylamine and 1MCP treatments in apple fruit[J].Postharvest biology and technology，2017，123：33-50.
[5] CHANG C L.Proteomic identification of a potential sex biomarker for 2 fruit fly species at pupal stage[J].Journal of Asiapacific entomology，2017，20：125-131.
[6] D’AMBROSIO C，ARENA S，ROCCO M，et al.Proteomic analysis of apricot fruit during ripening[J].Journal of proteomics，2013，78：39-57.
[7] SNCHEZBEL P，EGEA I，SNCHEZBALLESTA T T，et al.Understanding the mechanisms of chilling injury in bell pepper fruits using the proteomic approach[J].Journal of proteomics，2012，75（17）：5463-5478
[8] 李新明，郭志利，李群，等.無硫复合护色剂处理的干制苹果片中差异蛋白表达的分析[J].安徽农业科学，2017，45（28）：71-73.