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近年来不管是再生医学技术还是组织工程研究,重要环节均为寻找到具有多向分化潜力与自我更新能力种子细胞。人牙龈间充质干细胞(Human gingival mesenchymal stem cells,hGMSCs)相较于其他间充质干细胞而言,最大的优势是在量上、途径上都易得,同时有愈来愈多的研究表明了其具有很强的多向分化潜力,可以在各种细胞因子诱导下分化成软骨样细胞、骨样细胞、内皮样细胞以及平滑肌样细胞等,有望安全、高效地应用于临床软硬组织再生。随着传统中医学逐步受到重视,越来越多的中药被开发与应用。麝香发挥“开窍醒神,活血通经,止痛”的作用,麝香酮是麝香的有效组分之一。上世纪,麝香酮已被应用在缓解心绞痛、治疗冠状动脉心脏病、改善大脑中动脉的血管重塑;同时能够通过提高细胞毒作用、促进癌细胞凋亡、改变癌基因和抑癌基因的表达水平起到抗肿瘤的作用。多项研究证实麝香酮能够提高骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化能力,促进外源性大鼠骨髓间充质干细胞在模型大鼠体内的迁移作用。然而麝香酮对功能相似的牙龈间充质干细胞增殖、分化、迁移能力的影响未见报道。Wnt系列通路是十分重要的信号传导通路,它在胚胎发育与形成过程中发挥着至关重要的作用,同时与维持生物体组织稳态也紧密相关,已有研究表明Wnt/β-catenin信号转导通路参与并影响间充质干细胞活性和功能,包括增殖和分化过程。因此,本实验探究麝香酮对体外培养的人牙龈间充质干细胞增殖迁移和分化能力的影响,从而为牙龈干细胞进一步应用于在组织工程与再生医学提供理论依据。目的:本研究目的在于探究麝香酮在体外培养环境下对人牙龈间充质干细胞增殖迁移和分化能力作用;并探索Wnt/β-catenin信号通路在麝香酮影响人牙龈间充质干细胞分化过程中的作用,为麝香酮与人牙龈间充质干细胞在组织再生领域的应用可行性提供理论依据。方法:(1)分离培养hGMSCs:采用有限稀释法从门诊牙拔除术切除健康牙龈组织中分离培养原代hGMSCs,取生长状态良好第3～5代hGMSCs进行以下研究。(2)细胞生长活性检测:采用细胞活性试剂盒及克隆形成率实验检测不同浓度的麝香酮对hGMSCs增殖状态的影响。(3)细胞迁移能力检测:利用划痕实验和Transwell小室实验测定不同浓度麝香酮对hGMSCs迁移趋化的影响。(4)成骨分化能力检测:利用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色、活性实验检测不同浓度麝香酮作用7d、14d时hGMSCs的ALP活性;用茜素红染色检测不同浓度麝香酮作用21d时hGMSCs钙化结节的形成情况,并进行钙定量;用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测不同浓度麝香酮作用后hGMSCs成骨相关基因 ALP和 Runt相关转录因子(Runt related transcription factor2,RUNX-2)mRNA水平的表达情况。(5)成脂分化能力检测:油红O染色检测不同浓度麝香酮作用21d时hGMSCs脂滴形成情况,并进行脂滴定量;用qRT-PCR检测不同浓度麝香酮作用后hGMSCs成脂相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARy)和脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LPL)mRNA 水平的表达情况。(6)麝香酮对hGMSCs分化能力影响的机制研究:利用qRT-PCR和Western Blot检测氯化锂(Wnt/β-catenin信号通路激活剂)对麝香酮促进hGMSCs成脂和抑制成骨的影响。(7)统计分析:选取SPSS 20软件对实验数据比较分析,选择单因素方差分析对多组实验数据间进行比较,选择t检验对两组实验数据间进行比较,选择配对t检验对两组实验数据不同时间点进行比较,P<0.05为具有统计学意义。结果:麝香酮对人牙龈间充质干细胞有明显的促进其增殖与迁移作用,在麝香酮浓度为6mg/L时,促进作用最为显著(P<0.05);同时麝香酮也促进了人牙龈间充质干细胞细胞内脂肪滴的形成,抑制ALP活性和矿物质沉积,脂滴定量和钙定量显示具有明显的统计学意义(P<0.05);ALP,RUNX-2的基因表达均相较于对照组下调,而PPARγ,LPL的基因表达则上调(P<0.05)。此外,氯化锂影响了Wnt/β-catenin信号通路在麝香酮对人牙龈间充质干细胞抑制成骨分化、促进成脂分化的作用。结论:(1)麝香酮在一定程度上提高了人牙龈间充质干细胞迁移增殖能力。(2)麝香酮在一定程度上促进人牙龈间充质干细胞成脂分化、抑制人牙龈间充质干细胞成骨分化。(3)Wnt/β-catenin信号通路与麝香酮对人牙龈间充质干细胞促进成脂分化和抑制成骨分化密切相关。