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研究背景:近年来,随着人口老龄化的不断上升,我国脑血管疾病的发病率、死亡率也逐渐上升,其中脑梗死(缺血性脑卒中)所占的比例最高。脑梗死是指脑血液循环障碍导致的组织缺血、缺氧,进而出现局限性脑组织的坏死和软化。目前的观点认为脑梗死是环境和遗传因素共同作用和影响的结果,而基因多态性是遗传因素的主要表现形式。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性已被报道与癌症、妊娠相关高血压、糖尿病、脑血管疾病等多种疾病有关,且目前已有研究认为MTHFR基因多态性可通过影响同型半胱氨酸水平进而影响脑梗死的发生发展。因此,研究MTHFR基因多态性与脑梗死相关性及其生物学机制,对于脑梗死的预防和治疗具有积极的临床意义。第一部分MTHFR基因型检测及与脑梗死相关性分析目的:探讨MTHFR基因C677T和A1298C位点多态性与脑梗死易感性的相关性。方法:1.收集2017年10月至2018年10月于延安大学咸阳医院神经内科就诊的204例脑梗死患者为观察组,收集同期门诊无脑血管病史体检者210例为对照组。统计患者的一般资料并检测临床指标进行比较,包括年龄、身高、体重、性别、是否患有高血压、是否患有糖尿病、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖、同型半胱氨酸(Hcy)。2.分别检测两组患者MTHFR C677T和A1298C位点的基因型,检验两组的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡,随后比较组间基因型和等位基因的分布频率,以P<0.05为差异有统计学意义。3.将两组间差异有统计学意义的指标进行Logistic回归,分析脑梗死的独立影响因素。4.使用haploview进行C677T和A1298C位点间的连锁不平衡反应。结果:1.观察组和对照组在Hcy、高血压指标上差异显著(P<0.05)。2.两组患者C677T和A1298C位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡,且C677T和A1298C位点基因型分布差异均有统计学意义(P<0.05)。3.Logistic回归分析显示,高Hcy水平、C677T位点的CC和CT基因型、A1298C位点的CC基因型、高血压是脑梗死发生的危险因素。4.连锁不平衡分析显示,C677T和A1298C位点间存在连锁不平衡反应,且其单倍型分布频率分别为AT=54.3%,AC=29.3%,CC=13.7%,CT=2.7%。结论:1.Hcy水平、C677T位点多态性、A1298C位点多态性和高血压是脑梗死的独立影响因素。2.MTHFR基因C677T和A1298C位点存在连锁不平衡反应。第二部分MTHFR基因多态性与脑梗死相关性的生物学机制研究目的:结合生物信息学分析C677T和A1298C位点可能影响脑梗死的生物学机制。方法:1.NCBI数据库查询MTHFR核酸和蛋白序列以及基因多态性位点,ProtParam分析MTHFR蛋白基本理化性质。2.PSORT分析MTHFR的亚细胞定位。3.KEGG信号通路和STRING蛋白互做网络分析MTHFR所参与的信号通路和可能的生物学功能。4.NCBI保守结构域分析MTHFR的保守结构域,并使用Phyre2分析其二级结构。5.3D Ligandsite分析MTHFR蛋白配体结合位点,了解其基本结构特点。6.Quark进行C677T和A1298C位点局部建模,比较不同基因型对应的蛋白结构差异。结果:1.基本理化性质分析显示,MTHFR共有656个氨基酸残基,亲脂亲水,结构不稳定,C677T和A1298C位点不同基因型对应理化性质没有变化。2.亚细胞定位显示MTHFR主要定位在细胞质中。3.KEGG信号通路分析显示其参与途径主要为叶酸代谢通路。4.保守结构域分析显示,MTHFR仅有一个MTHFR超家族结构域,且C677T位点位于转角处,A1298C位点位于α螺旋结构中。5.3D Ligandsite分析显示MTHFR配体分别为FAD、SAH和CIT,且C677T位点靠近FAD配体结合区域。6.基因多态性位点局部建模显示,C677T位点突变前后蛋白结构由一个α螺旋和一个β折叠,变为一个α螺旋结构。A1298C位点不同基因型结构并未发生明显变化,均为两个α螺旋结构。结论:1.MTHFR可能通过参与叶酸代谢途径影响脑梗死的发生和发展。2.MTHFR C677T位点多态性可能通过影响蛋白质局部结构改变,影响MTHFR与其配体的结合,通过改变叶酸代谢水平进而影响了脑梗死的发生发展。全文结论:本研究整体结论如下:MTHFR C677T和A1298C位点多态性是脑梗死的独立影响因素,其影响机制可能是C677T位点通过基因型的改变引起蛋白质局部结构的改变,影响了MTHFR与其配体的结合,进而影响了脑梗死的发生。A1298C位点与脑梗死的相关性可能与C677T位点间的连锁不平衡反应有关。