论文部分内容阅读
目的复制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化损伤模型,从TBX20/PPARγ/PON2信号通路的角度探究齐墩果酸(oleanolic acid,OA)对该模型的保护作用。方法CCK-8筛选ox-LDL作用24h后损伤HUVECs的合适浓度、OA细胞毒性以及OA预保护时间和浓度。实验设计分组为:正常对照组、ox-LDL模型组、OA药物组(10,20,40μmol/L);酶化学方法检测各分组细胞中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、一氧化氮(NO)、总一氧化氮合酶(NOS)的活性或含量;电子自旋共振(ESR)技术检测细胞内活性氧(ROS)自由基和一氧化氮(NO)自由基的生成量;Real-time PCR和Western bolt技术检测TBX20、PPARγ、PON2mRNA和蛋白的表达;脂质体瞬时siRNA转染以及加入抑制剂使细胞中蛋白表达沉默,Western blot检测TBX20、PPARγ、PON2蛋白表达变化。数据的统计学分析用SPSS软件。结果根据IC50,实验选取100μg/ml ox-LDL诱导的HUVEC细胞损伤模型;CCK-8结果显示:与模型组相比,10、20、40μmol/LOA预处理16h后,细胞存活率显著升高,且有量效依赖关系;酶化学方法检测表明:与正常组相比,模型组中CAT、GSH-PX、NOS活性及NO含量明显降低;而预先给予不同浓度OA预处理16h后,可量效依赖性提高CAT、GSH-PX、NOS活性,增加NO含量(与模型组相比,P<0.05)。ESR结果显示:模型组中ROS含量明显增高,而NO含量降低;OA(10、20、40μmol/L)预处理16h后,此时各组细胞中ROS含量与模型组比会显著降低,而NO含量会升高(P<0.05)。RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测结果表明:模型组中TBX20、PPARγ、PON2 mRNA和蛋白表达水平较正常组显著降低,而各剂量OA组中这三者mRNA和蛋白表达水平均较模型组显著升高,且随OA剂量的增加对TBX20、PPARγ、PON2表达的激活作用逐渐增强,呈剂量依赖关系(P<0.05);T-bx-siRNA转染HUVECs细胞后,荧光显微镜检测转染率可达90%,Western bolt结果显示与TBX20未沉默组相比,TBX20、PPARγ、PON2表达量明显降低(P<0.05);在OA预处理之前提前给予PPARγ抑制剂GW9662(10μmol/L)孵育2h,Western blot结果显示PPARγ、PON2蛋白水平均明显降低(P<0.05),而TBX20蛋白表达量几乎没有变化。结论100μg/mL ox-LDL抑制TBX20/PPARγ/PON2信号通路加速HUVECs氧化损伤;而OA通过激活TBX20/PPARγ/PON2信号通路保护ox-LDL诱导的HUVECs损伤。