西瓜是世界范围内广泛种植的水果和经济作物,在农业生产中占有重要地位。西瓜起源于热带沙漠地区,喜温喜光,而我国北方地区早春温度较低,严重影响了西瓜的产量和品质。同时设施栽培的面积不断扩大,土壤次生盐渍化成为设施栽培中难以解决的问题,严重制约西瓜产业发展。因此,西瓜耐低温和耐盐性的研究具有重要的生产意义。WRKY转录因子在植物对各种逆境的响应中发挥重要的作用。本课题组前期研究中,从西瓜基因组鉴定得到57条西瓜WRKY转录因子,对57个转录因子在低温下的表达进行了分析,筛选到了显著响应低温胁迫的ClWRKY20转录因子。但其胁迫应答机制及功能尚不清楚。因此本研究克隆了ClWRKY20基因,通过构建过量表达载体转入拟南芥的方法,重点分析了过表达ClWRKY20转基因拟南芥的耐盐和耐低温能力,同时利用转录组测序技术初步分析了ClWRKY20基因的低温调控途径,主要结果如下:(1)从西瓜中克隆到ClWRKY20转录因子基因,ClWRKY20基因开放阅读框全长1023bp编码340个氨基酸,蛋白分子质量是37.94KD,等电点4.94。在NCBI进行比对分析发现ClWRKY20与甜瓜(Cucumis melo)、黄瓜(Cucumis sativus)、香瓜(Cucumis melo var.makuwa)等的WRKY46相似性达到75%以上。(2)ClWRKY20基因在根、茎、叶都有不同程度的表达,在叶片中表达量最高。荧光定量PCR分析表明ClWRKY20基因可以被水杨酸、甘露醇、乙烯利、过氧化氢、氯化钠和机械损伤等逆境胁迫和信号分子处理诱导表达,因此该基因可能参与多种植物逆境反应和信号转导途径。(3)ClWRKY20蛋白定位于细胞核。构建pH7LIC5.0-N-eGFP-ClWRKY20融合表达载体并在本氏烟草瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察荧光分布情况,结果发现绿色荧光仅分布在细胞核,这符合转录因子的功能特性。(4)转基因拟南芥植株的获得。构建PMDC32-ClWRKY20过表达载体,并遗传转化拟南芥。得到OE1、OE2、OE5三个过表达ClWRKY20的转基因拟南芥纯合株系。(5)过表达ClWRKY20提高了拟南芥的低温抗性。正常培养条件下,野生型和转基因植株生长状态无明显差别,4℃处理7d后,转基因植株根长明显长于野生型植株。-20℃处理1h,并放置4℃解冻12h,最后放置正常条件恢复7d,与转基因植株相比,野生型植株死亡率明显上升,萎蔫程度更严重。测定相关生理生化指标,转基因植株的电导率和丙二醛含量明显低于野生型植株,同时积累了更多的脯氨酸,说明转基因植株膜系统受损较轻。相比于野生型植株,转基因植株F0值增加较少,Fv/Fm值均下降幅度小,光抑制程度较低。这些数值充分地说明了将ClWRKY20导入到拟南芥植株中以后可以明显的提高其对低温的耐受能力。(6)过表达ClWRKY20提高了拟南芥的耐盐性。盐处理后,转基因植株萌发率和根长明显高于野生型植株。同时盐胁迫处理后,与野生型植株相比,转基因植株的抗盐表型表现更加明显。转基因植株电解质渗透率和丙二醛含量低于野生型植株,说明转基因植株膜脂氧化程度较低。野生型植株积累了较多脯氨酸,说明野生型植株对高盐敏感。这些均表明过表达ClWRKY20基因显著地提高了拟南芥植株的盐胁迫抗性。(7)转录组结果表明,野生型与转基因拟南芥的差异表达基因主要集中在植物激素信号通路,其中生长素和茉莉酸信号通路上调表达显著,在生长素途径中,一些基因比如AUX1,AUX/IAA基因在转基因植株低温处理后基本都显著上调,在野生型植株低温处理后基本下调或无显著变化。在茉莉酸信号途径上,AT1G32630基因在转基因植株未经低温处理时就已经高表达,在野生型和转基因植株低温处理后均明显上调,这表明ClWRKY20可能通过生长素和茉莉酸信号通路提高转基因植株耐冷性,但是其具体的调控机制还需要进一步的实验进行验证。