论文部分内容阅读
盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌和重要生防菌。为了明确盾壳霉寄生核盘菌和抑制核盘菌子囊孢子侵染的机制从而更好地利用盾壳霉资源,本研究开展了对盾壳霉几丁质酶的产生条件、基本性质、分离纯化以及与核盘菌关系等方面的研究。 在比较马铃薯培养液(mPDB)和一种合成营养液(SMCS)对盾壳霉几丁质酶产量的基础上,摸索出了一个盾壳霉产生几丁质酶的最佳培养基。其配方是:去皮马铃薯200 g,葡萄糖0.5%(w/v),硝酸钾0.1%(w/v),水1000 mL,pH为6.5。在这种培养液中接种盾壳霉分生孢子(108个孢子/50 mL培养液),并在20℃下振荡(200 r/min)培养15 d可获得较高的几丁质酶产量。从多种碳源对盾壳霉几丁质酶产量的影响来看,用该酶的反应产物(N—乙酰氨基葡萄糖)较其反应底物(几丁质)能更有效地诱导盾壳霉产生几丁质酶。在含有草酸(100-3000 μg/mL)的培养液中,盾壳霉通过生长使培养液的pH值上升至8左右,几丁质酶的产量明显提高。 盾壳霉几丁质酶降解几丁质反应的最适温度为50℃,最适pH值为8.0。几丁质酶的热变性失活温度是60℃,高于该温度时,几丁质酶完全丧失催化活力。在pH 5-7范围内几丁质酶活性较稳定。金属离子对酶活性的影响较大,其中Mg2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+等金属离子对几丁质酶活性发挥有一定的促进作用,能显著提高该酶的催化活力,而Zn2+和Cu2+则对几丁质酶酶促发应具有抑制作用。一定浓度的硼酸(100 mmol/L)和低浓度的草酸溶液(<8 mmol/L)对几丁质酶活性也具有促进作用。 采用盐析透析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析等程序对盾壳霉几丁质酶进行了分离纯化。结果表明盐析透析后可有效浓缩盾壳霉培养液中的几丁质酶;用Tris-HCl(0.05mol/L,pH 8.0)-NaCl(0.8mol/L)为洗脱液,以2 mL/min流速洗脱DEAE-Sepharose FF层析柱上的混合蛋白质可较好地分离出几丁质酶组分。但由于几丁质酶含量太低,所以采用Sephacryl S-300HR凝胶过滤层析没有获得较好的分离效果。 从盾壳霉寄生的核盘菌菌核组织中未检测到几丁质酶活性,说明几丁质酶对盾壳霉寄生核盘菌的作用可能不大。平板测定表明盐析透析后的几丁质酶样品和DEAE—Sepharose FF层析分离得到的几丁质酶样品对核盘菌菌丝生长没有明显的抑制作用。这可能与几丁质酶浓度过低有关。