睾丸生殖细胞肿瘤是近年来发病率呈明显上升趋势的一种男性生殖细胞肿瘤。流行病学及临床病理学的研究发现:睾丸萎缩、隐睾和不育是诱发睾丸生殖细胞肿瘤发生的一些主要的高危因素。而通过近年的分子遗传学研究,对睾丸生殖细胞肿瘤的发生原因提出了一些分子水平上的论证,在临床病理标本的观察中发现一些非常敏感和特异的标志物,例如:M2A、CD117、OCT-4和AP-2γ等。AP-2γ作为近年来发现的睾丸生殖细胞瘤发生中新的分子标记物,有研究证实正常情况下AP-2γ蛋白在22周以前的男性胎儿睾丸组织中有表达,当胎儿发育到22周后,AP-2γ蛋白表达量会逐步下降,胎儿出生后直至成年期的正常男性睾丸组织中则检测不到AP-2γ蛋白的表达。但是,在睾丸生殖细胞肿瘤中它却异常高表达,这说明在睾丸生殖细胞肿瘤从良性到恶性的转变过程中,AP-2γ起重要的作用。故而,鉴定AP-2γ调控的下游基因,将对了解睾丸生殖细胞肿瘤的遗传机制有重要的意义。在本课题中,我们通过免疫组化方法,检测了睾丸生殖细胞肿瘤组织和正常睾丸中AP-2γ蛋白表达情况,发现AP-2γ在正常睾丸组织中不表达,睾丸癌组织中高表达。随后运用ChIP-on-chip芯片实验,筛选到2000多个AP-2γ的靶基因,它们大多与细胞周期、凋亡和迁移等相关,我们结合信号通路分析选择了TGF-β信号通路中重要成员SMAD4作为研究对象,本课题研究睾丸生殖细胞瘤中AP-2γ与SMAD4基因的调控关系。Western blot实验检测NTera-2、MCF-7和HEK293三种细胞系中AP-2γ和SMAD4蛋白表达情况,发现AP-2γ在NTera-2细胞中高表达,MCF-7细胞中有表达,HEK293细胞中未见表达,而SMAD4则在以上三种细胞系中均有表达。ChIP-PCR实验结果显示,在睾丸生殖细胞肿瘤NTera-2细胞中AP-2γ能够结合到SMAD4基因启动子上游区域。Luciferase assay结果表明AP-2γ能抑制SMAD4的转录活性并呈剂量依赖性。Western blot实验结果显示,AP-2γ负调控SMAD4蛋白的表达。免疫荧光共定位实验发现在NTera-2细胞中内源AP-2γ和SMAD4蛋白在细胞核内信号叠加明显有很好的共定位。克隆形成实验、MTT实验及细胞计数实验都表明了下调AP-2γ的表达能抑制睾丸生殖肿瘤细胞株的生长和增殖,而这种抑制作用可能是通过上调肿瘤抑制基因SMAD4的表达来实现的。小鼠隐睾动物模型实验中,通过RT-PCR实验结果也显示了AP-2γ可以负调控SMAD4的表达,与体外实验结果与体外细胞水平结果一致。有文献报道姜黄素可以抑制AP-2γ的表达,我们通过western blot实验证实随着姜黄素浓度梯度升高,AP-2γ蛋白表达也呈现梯度下降,而SMAD4的表达则梯度上升,进一步证实AP-2γ可以负调控SMAD4基因的表达。综上,我们首次证明SMAD4基因是AP-2γ的靶基因,AP-2γ对SMAD4基因表达起负调控作用。AP-2γ调控睾丸生殖肿瘤细胞的生长和增殖可能是通过影响SMAD4的表达来实现的。这些研究为睾丸生殖细胞瘤发生过程中,AP-2γ参与调控TGF-β信号通路促进睾丸生殖细胞肿瘤的发生,进一步深入研究打下了基础。